PCR的種類(lèi)及應(yīng)用

1、PCRPCR的種類(lèi)及應(yīng)用的種類(lèi)及應(yīng)用 學(xué)號(hào)：21014017 王志慧 序2022-2-91 PCRPCR的歷史的歷史操作過(guò)程操作過(guò)程 引物引物 步驟步驟 PCRPCR的各種變體的各種變體PCRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用鑒定基因鑒定基因親子鑒定親子鑒定診斷遺傳病診斷遺傳病克隆基因克隆基因誘變誘變分析遠(yuǎn)古分析遠(yuǎn)古DNADNA鑒定特定表型的突變體基因鑒定特定表型的突變體基因比較基因表達(dá)量比較基因表達(dá)量 目錄目錄2022-2-93PCRPCR這項(xiàng)技術(shù)是由凱利這項(xiàng)技術(shù)是由凱利穆利斯穆利斯(Kary Mullis)(Kary Mullis)發(fā)明，并因此在發(fā)明，并因此在七年之后，七年之后，19931993年年101

2、0月，獲得了月，獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)該項(xiàng)殊榮。穆利斯諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)該項(xiàng)殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，的想法是，利用一種人工方法，和反復(fù)相同程序的方法，并利用和反復(fù)相同程序的方法，并利用一種特殊的酶一種特殊的酶即即DNADNA聚合酶聚合酶來(lái)擴(kuò)增特定的來(lái)擴(kuò)增特定的DNADNA片段。片段。PCRPCR 歷史歷史 2022-2-9DNA的復(fù)制 DNA DNA在復(fù)制時(shí)，雙鏈在復(fù)制時(shí)，雙鏈DNADNA解解旋成兩股分別進(jìn)行。其復(fù)制過(guò)程的復(fù)旋成兩股分別進(jìn)行。其復(fù)制過(guò)程的復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，故稱(chēng)復(fù)制叉。制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，故稱(chēng)復(fù)制叉。以復(fù)制叉向前移動(dòng)的方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，一以復(fù)制叉向前移動(dòng)的方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，一條

3、模板鏈為條模板鏈為3355走向，在其上走向，在其上DNADNA能以能以5533方向連續(xù)合成，方向連續(xù)合成，稱(chēng)為前導(dǎo)鏈稱(chēng)為前導(dǎo)鏈(leading strand)(leading strand)；另一；另一條模板鏈為條模板鏈為5533走向，在其上走向，在其上DNADNA也是也是5533方向合成，但與方向合成，但與復(fù)制叉移動(dòng)的方向正好相反，故隨著復(fù)制叉移動(dòng)的方向正好相反，故隨著復(fù)制叉的移動(dòng)形成許多不連續(xù)的岡崎復(fù)制叉的移動(dòng)形成許多不連續(xù)的岡崎片段，最后在連成一條完整的片段，最后在連成一條完整的DNADNA鏈，鏈，該鏈稱(chēng)為后隨鏈該鏈稱(chēng)為后隨鏈(lagging strand)(lagging strand

4、)。2022-2-95 5 533的聚合作用：不是復(fù)制染色體而是的聚合作用：不是復(fù)制染色體而是修補(bǔ)修補(bǔ)DNADNA，填補(bǔ)，填補(bǔ)DNADNA上的空隙或是切除上的空隙或是切除RNARNA引引物后留下的空隙。物后留下的空隙。3 355的外切酶活性：消除在聚合作用中的外切酶活性：消除在聚合作用中摻入的錯(cuò)誤核苷酸。摻入的錯(cuò)誤核苷酸。5 533外切酶活性：切除受損傷的外切酶活性：切除受損傷的DNADNA，可用于切口平移（可用于切口平移（nick translation).nick translation). 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶的的KlenowKlenow片段是完片段是完整的整的DNA

5、DNA聚合酶聚合酶的一個(gè)片段，只有在的一個(gè)片段，只有在5 533聚聚合酶活性和合酶活性和3 355外切酶活性，失去了外切酶活性，失去了5 533外外切酶活性。它可用于填補(bǔ)切酶活性。它可用于填補(bǔ)DNADNA單鏈末端成為雙單鏈末端成為雙鏈。鏈。 DNA聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌聚合酶是從一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yT1(Thermusaquaticus)yT1株株分離提取的分離提取的.yT.yT是是 一種嗜熱真菌，能在一種嗜熱真菌，能在70-7570-75生長(zhǎng)生長(zhǎng). .存在于水生嗜熱存在于水生嗜熱菌菌(Thermus aquaticus)(

6、Thermus aquaticus)的嗜熱的嗜熱DNADNA聚合酶，可在聚合酶，可在7474復(fù)制復(fù)制DNADNA，在，在9595仍具有酶活力。該酶可在離體條件下，以仍具有酶活力。該酶可在離體條件下，以DNADNA為模板，延伸引物為模板，延伸引物，合成雙鏈，合成雙鏈DNADNA。這個(gè)酶只有。這個(gè)酶只有53DNA53DNA聚合酶活性和聚合酶活性和5353的外的外切酶活性，缺少切酶活性，缺少3535的外切酶活性。的外切酶活性。 該酶基因全長(zhǎng)該酶基因全長(zhǎng)24962496個(gè)堿基，編個(gè)堿基，編碼碼832832個(gè)氨基酸，酶蛋白分子為個(gè)氨基酸，酶蛋白分子為 94KDa.94KDa.其比活性為其比活性為2000

7、00200000單位單位/mg.75/mg.758080時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘可延伸約可延伸約150150個(gè)核苷個(gè)核苷 酸，酸，7070延伸延伸率大于率大于6060個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸/ /秒，秒，5555時(shí)為時(shí)為2424個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸/ /秒秒. .溫度過(guò)高溫度過(guò)高(90(90以以上上) ) 或過(guò)低或過(guò)低(22)(22)都可影響都可影響Taq Taq DNADNA聚合酶的活性，該酶雖然在聚合酶的活性，該酶雖然在9090以上幾乎無(wú)以上幾乎無(wú)DNADNA合成，合成， 但確有但確有良好的熱穩(wěn)定性，在良好的熱穩(wěn)定性，在PCRPCR循環(huán)的高循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性溫條件下仍能保持

8、較高的活性. . Taq DNA聚合酶2022-2-97 PCR（Polymerase Chain Reaction） 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱(chēng)為基因的體外擴(kuò)增。 它可以在試管里建立反應(yīng)，經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)之后，就能將極微量的目的基因或者某一特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬(wàn)倍，乃至千百萬(wàn)倍，而無(wú)需通過(guò)繁瑣費(fèi)時(shí)的基因克隆程序，便可獲得足夠數(shù)量的精確的DNA拷貝，所以有人亦稱(chēng)為無(wú)細(xì)胞的分子克隆法。PCR的定義PCR 操作過(guò)程操作過(guò)程1、預(yù)變性（、預(yù)變性（Initial denaturation） 模板模板DNA完全變性完全變性對(duì)對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，一般能否成

9、功至關(guān)重要，一般95加熱加熱3-5分鐘。分鐘。 2、引物退火（、引物退火（Primer annealing） 退火溫度一般需要退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)（經(jīng)驗(yàn)）決定。憑實(shí)驗(yàn)（經(jīng)驗(yàn)）決定。 退火溫度對(duì)退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大的特異性有較大影響。影響。 3、引物延伸、引物延伸 引物延伸一般在引物延伸一般在72進(jìn)行（進(jìn)行（Taq酶最適溫酶最適溫度）。度）。 延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定。延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定。 4、循環(huán)中的變性步驟、循環(huán)中的變性步驟 循環(huán)中一般循環(huán)中一般95，30秒足以使各秒足以使各種靶種靶DNA序列完全變性：序列完全變性： 變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短

10、靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 5、循環(huán)數(shù)、循環(huán)數(shù) 大多數(shù)大多數(shù)PCR含含25-35循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特?zé)跹h(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特?zé)鯒l帶條帶6、最后延伸、最后延伸 在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72維持維持5-15分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物可以采取以下原則：設(shè)計(jì)引物可以采取以下原則： GC所占比例為所占比例為4060 兩個(gè)引物的兩個(gè)引物的Tm，相差小于相差小于5，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm與引物的相差不超與引物的相差不超過(guò)過(guò)10。 黏合溫度通常比計(jì)算的最

11、低黏合溫度通常比計(jì)算的最低Tm低低5，但是要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)為不同條件下的，但是要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)為不同條件下的PCR選擇不同的黏合溫度。選擇不同的黏合溫度。 內(nèi)部的具有自身互補(bǔ)性的發(fā)卡結(jié)構(gòu)不超過(guò)內(nèi)部的具有自身互補(bǔ)性的發(fā)卡結(jié)構(gòu)不超過(guò)4個(gè)，其二聚體中不超過(guò)個(gè)，其二聚體中不超過(guò)8個(gè)個(gè)。 3末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補(bǔ)的序列，并且要與模板完末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補(bǔ)的序列，并且要與模板完全互補(bǔ)。倒數(shù)第二個(gè)最好是全互補(bǔ)。倒數(shù)第二個(gè)最好是G/CPCR的各種變體的各種變體 反向反向PCR (Inverse PCR, PCR (Inverse PCR, IPCR)IPCR) 不對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)PCR (as

12、ymmetric PCR (asymmetric PCR)PCR) 多重多重PCRPCR 熒光定量熒光定量PCRPCR（Q-PCR)Q-PCR) 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse PCR (reverse transcription,RTtranscription,RT- PCR- PCR) ) 巢式巢式PCR (NEST PCR)PCR (NEST PCR) 遞減遞減PCR(Touchdown PCR)PCR(Touchdown PCR)2022-2-910 原理：原理：擴(kuò)增引物相反方向擴(kuò)增引物相反方向DNADNA 序列的技術(shù)序列的技術(shù)。用反向。用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的未知序列

13、的片段，的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)而常規(guī)PCRPCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNADNA片段片段. .實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒(méi)有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒(méi)有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段對(duì)該段DNADNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCRPCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究序進(jìn)行分析研究. . 2022-2-911已知序列已知序列未知

14、序列未知序列反向PCR (Inverse PCR, IPCR)1. 1. 用一種在靶序列上沒(méi)有用一種在靶序列上沒(méi)有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶 消化消化大分子量的大分子量的DNADNA2. 2. 產(chǎn)生的大小不同的線性產(chǎn)生的大小不同的線性DNADNA片段群體，其中具靶片段群體，其中具靶DNADNA區(qū)段的區(qū)段的DNADNA分子長(zhǎng)度不超過(guò)分子長(zhǎng)度不超過(guò)2-3Kb,2-3Kb,經(jīng)連接后環(huán)化成環(huán)狀經(jīng)連接后環(huán)化成環(huán)狀分子分子3. 3. 按靶序列設(shè)計(jì)的一對(duì)向按靶序列設(shè)計(jì)的一對(duì)向外引物同靶序列外引物同靶序列5 5，-端互補(bǔ)端互補(bǔ)序列退火結(jié)合，其延伸方向序列退火結(jié)合，其延伸方向如圖中箭頭所指如圖中箭頭所

15、指4. 4. 經(jīng)經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)生的主要是擴(kuò)增產(chǎn)生的主要是線性雙鏈線性雙鏈DNADNA分子，它是由分子，它是由左側(cè)的序列和右側(cè)序列首位左側(cè)的序列和右側(cè)序列首位連接而成，其接點(diǎn)就是限制連接而成，其接點(diǎn)就是限制酶的識(shí)別位點(diǎn)酶的識(shí)別位點(diǎn)2022-2-912應(yīng)用應(yīng)用： 利用反向利用反向PCRPCR可對(duì)未知序可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知已知DNADNA片段的序列，并可將片段的序列，并可將僅知部分序列的全長(zhǎng)僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNAcDNA進(jìn)行進(jìn)行分子克隆，建立全長(zhǎng)的分子克隆，建立全長(zhǎng)的DNADNA探探針。針。 應(yīng)用于染色體步移、轉(zhuǎn)位應(yīng)用于染色體步移、轉(zhuǎn)位因子和已

16、知序列因子和已知序列DNADNA旁側(cè)病毒旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。整合位點(diǎn)分析等研究。局限性局限性： 需要從許多酶中選擇限制需要從許多酶中選擇限制酶，或者說(shuō)必須選擇一種合適酶，或者說(shuō)必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的小的DNADNA片段。這種選擇不能片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNADNA。 大多數(shù)有核基因組含有大大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在量中度和高度重復(fù)序列，而在YACYAC或或CosmidCosmid中的未知功能序中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過(guò)反向樣，通過(guò)反向

17、PCRPCR得到的探針得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。就有可能與多個(gè)基因序列雜交。2022-2-913 就像任何就像任何DNADNA一樣，一樣，PCRPCR的雙鏈的雙鏈DNADNA產(chǎn)物也可以供序列測(cè)定產(chǎn)物也可以供序列測(cè)定使用。使用。 然而，按照然而，按照SangerSanger雙脫氧末端鏈終止法測(cè)定雙脫氧末端鏈終止法測(cè)定DNADNA的核的核苷酸序列，最好是使用單鏈模版苷酸序列，最好是使用單鏈模版DNADNA。 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一種專(zhuān)門(mén)用于制備單鏈種專(zhuān)門(mén)用于制備單鏈DNADNA的技術(shù)的技術(shù)不對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)PCRPCR技術(shù)。技術(shù)。 這種技術(shù)，除了使用的兩種引物濃度相差這種技術(shù)，

18、除了使用的兩種引物濃度相差100100倍以外，其倍以外，其他的方面跟常規(guī)他的方面跟常規(guī)PCRPCR技術(shù)沒(méi)有什么本質(zhì)的區(qū)別。技術(shù)沒(méi)有什么本質(zhì)的區(qū)別。 不對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)PCRPCR 2022-2-914基本原理：基本原理： PCRPCR擴(kuò)增所用的兩條引物中，擴(kuò)增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高濃度的濃度受限制的只及高濃度的1%1%（或或2%2%）。）。 經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)PCRPCR循環(huán)直到限制循環(huán)直到限制引物耗盡之前，擴(kuò)增的引物是雙引物耗盡之前，擴(kuò)增的引物是雙鏈的鏈的DNADNA序列。而后，反應(yīng)混合序列。而后，反應(yīng)混合物中的另一種高濃度的引物，則物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合成的利用限制引物合

19、成的DNADNA鏈做模鏈做模板，繼續(xù)引導(dǎo)板，繼續(xù)引導(dǎo)DNADNA合成。合成。這樣模板鏈繼續(xù)再循環(huán)，由高濃這樣模板鏈繼續(xù)再循環(huán)，由高濃度的引物合成的度的引物合成的DNADNA要比限制引要比限制引物多得多，而且仍保持單鏈狀態(tài)物多得多，而且仍保持單鏈狀態(tài)。 2022-2-915不對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)PCRPCR的原理的原理多重多重PCRPCR 一般一般PCRPCR僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過(guò)僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過(guò)PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定主要用于單一致病因子等的鑒定. .多重多重PCR(multiplex PCR)PCR(multiplex PCR)，又稱(chēng)多重引

20、物又稱(chēng)多重引物PCRPCR或復(fù)合或復(fù)合PCRPCR，它是在同一，它是在同一PCRPCR反應(yīng)體系里加反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCRPCR反應(yīng)，其反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與一般反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與一般PCRPCR相同相同多重多重PCRPCR的試驗(yàn)步驟的試驗(yàn)步驟 同一般的同一般的PCRPCR操作相同，只是反應(yīng)中所加入的是多對(duì)引物而不是一對(duì)引物。操作相同，只是反應(yīng)中所加入的是多對(duì)引物而不是一對(duì)引物。1. DNA1. DNA提?。禾崛。篋NADNA提取可以用提取可以用DNADNA提取試劑盒或?qū)嶒?yàn)室常用的一些提取試劑

21、盒或?qū)嶒?yàn)室常用的一些DNADNA提取方法進(jìn)行。提取方法進(jìn)行。2. DNA2. DNA定量：用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量：用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNADNA含量測(cè)定。含量測(cè)定。3. 3. 多重多重PCRPCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系可以選定為擴(kuò)增：反應(yīng)體系可以選定為20l20l，50l50l等，反應(yīng)體系中含有：等，反應(yīng)體系中含有：DNADNA模模板，板，Mg+Mg+，dNTPdNTP，Taq DNATaq DNA聚合酶，各種引物等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)計(jì)合適的循環(huán)聚合酶，各種引物等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)計(jì)合適的循環(huán)參數(shù)。在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)要注意兩個(gè)原則：一是退火溫度要足夠高。這是因?yàn)?，參?shù)。在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)要注意兩個(gè)原則

22、：一是退火溫度要足夠高。這是因?yàn)?，多重多重PCRPCR技術(shù)是在擴(kuò)增體系中加入了多對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，這樣就會(huì)由于錯(cuò)配而技術(shù)是在擴(kuò)增體系中加入了多對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，這樣就會(huì)由于錯(cuò)配而產(chǎn)生一些非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)產(chǎn)生一些非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的生成；二是循環(huán)參數(shù)要盡量少，以利于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。多重物的生成；二是循環(huán)參數(shù)要盡量少，以利于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。多重PCRPCR在一個(gè)反應(yīng)體在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNADNA段，其擴(kuò)增效率并不是完全相同的，循環(huán)參數(shù)的增加，會(huì)使段，其擴(kuò)增效率并不是完全相同的，循

23、環(huán)參數(shù)的增加，會(huì)使TaqTaq酶的消耗增加，再加上每對(duì)引物相對(duì)退火效率不同，就會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物混亂，所酶的消耗增加，再加上每對(duì)引物相對(duì)退火效率不同，就會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物混亂，所以，循環(huán)次數(shù)不宜過(guò)多。以，循環(huán)次數(shù)不宜過(guò)多。4. 4. 電泳檢測(cè)及結(jié)果分析：取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)及結(jié)果分析：取擴(kuò)增產(chǎn)物1010與與2626載樣緩沖液載樣緩沖液( (溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)) )混勻上樣，混勻上樣，同時(shí)加入分子量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)同時(shí)加入分子量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2 2瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠( (含含0.5g/ml E0.5g/ml E、恒壓、恒壓(200-600V)(200-600V)、電、電泳泳1-21-2小時(shí)后，置凝膠于紫外檢測(cè)凝膠分析儀觀察結(jié)果

24、，并拍照，記錄分析結(jié)果。小時(shí)后，置凝膠于紫外檢測(cè)凝膠分析儀觀察結(jié)果，并拍照，記錄分析結(jié)果。 多重多重PCRPCR的主要用于多種病原的主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定和病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。分型鑒定。 1 1）多種病原微生物的同時(shí)檢）多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定，是在同一測(cè)或鑒定，是在同一PCRPCR反應(yīng)管反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行異性引物，進(jìn)行PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增. . 2 2）某些病原微生物，某些）某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或遺傳病或癌基因

25、，型別較多，或突變或缺失存在多個(gè)好發(fā)部位，突變或缺失存在多個(gè)好發(fā)部位，多重多重PCRPCR可提高其檢出率并同時(shí)可提高其檢出率并同時(shí)鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應(yīng)用鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應(yīng)用的有的有: :乙型肝炎病毒的分型乙型肝炎病毒的分型; ;乳頭乳頭瘤病毒的分型瘤病毒的分型; ;單純皰疹病毒的單純皰疹病毒的分型分型; ;杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的分型杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的分型及癌基因的檢測(cè)等及癌基因的檢測(cè)等. .應(yīng)用熒光定量熒光定量PCR(Q-PCR) Q-PCRQ-PCR：是指在：是指在PCRPCR反應(yīng)體系中加入熒反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)P

26、CRPCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號(hào)的變化行定量分析的方法。利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化物量的變化, ,通過(guò)通過(guò)CtCt值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析起始模板進(jìn)行定量分析 將模板稀釋成一系列的濃度梯度進(jìn)行將模板稀釋成一系列的濃度梯度進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)，用個(gè)這個(gè)結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線，模板反應(yīng)，用個(gè)這個(gè)結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線，模板可以用已知濃度的樣品或未知濃度的樣品可以用已知濃度的樣品或未知濃度的樣品。用模版初始量的。用模版初始量

27、的loglog值對(duì)每個(gè)稀釋樣品的值對(duì)每個(gè)稀釋樣品的CtCt值作圖，兩者稱(chēng)遞減的線性關(guān)系，稱(chēng)之值作圖，兩者稱(chēng)遞減的線性關(guān)系，稱(chēng)之為標(biāo)準(zhǔn)曲線。作標(biāo)準(zhǔn)曲線用來(lái)評(píng)定反應(yīng)條為標(biāo)準(zhǔn)曲線。作標(biāo)準(zhǔn)曲線用來(lái)評(píng)定反應(yīng)條件的優(yōu)化（保證樣本有準(zhǔn)確可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)件的優(yōu)化（保證樣本有準(zhǔn)確可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果）結(jié)果） Q-PCRQ-PCR 熒光化學(xué)方法1 1）DNADNA結(jié)合燃料（結(jié)合燃料（SYBR SYBR Green 1Green 1） SYBR Green 1 SYBR Green 1 是熒光定是熒光定量量PCRPCR最常用的最常用的DNADNA結(jié)合燃料，結(jié)合燃料，與與dsDNAdsDNA非特異性結(jié)合。在游非特異性結(jié)合。在

28、游離的狀態(tài)下，離的狀態(tài)下，SYBR Green 1SYBR Green 1發(fā)出微弱的熒光，但一旦與發(fā)出微弱的熒光，但一旦與dsDNAdsDNA結(jié)合，熒光強(qiáng)度增加結(jié)合，熒光強(qiáng)度增加10001000倍。倍。 缺乏特異性；缺乏特異性；不能用于多重反應(yīng)，因?yàn)椴徊荒苡糜诙嘀胤磻?yīng)，因?yàn)椴荒軈^(qū)分不同擴(kuò)增子發(fā)出的熒能區(qū)分不同擴(kuò)增子發(fā)出的熒光，用于單重實(shí)驗(yàn)光，用于單重實(shí)驗(yàn)。 2 2）熒光燃料標(biāo)記的序列特異性寡）熒光燃料標(biāo)記的序列特異性寡核苷酸引物或探針（核苷酸引物或探針（TaqManTaqMan和分和分子信標(biāo)）子信標(biāo)）TaqManTaqMan實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 主要優(yōu)點(diǎn)：高主要優(yōu)點(diǎn)：高特異性、高信噪比和能進(jìn)行特異性、高信

29、噪比和能進(jìn)行多重反應(yīng)。多重反應(yīng)。 缺點(diǎn)：探針的缺點(diǎn)：探針的初始成本比較高和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)初始成本比較高和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較繁瑣。比較繁瑣。 熒光報(bào)告基團(tuán)的種類(lèi)：熒光報(bào)告基團(tuán)的種類(lèi)：FAM(FAM(發(fā)綠色熒光發(fā)綠色熒光) )、HEXHEX、TAMRATAMRA、TexasTexas Red Red 和和Cy5Cy5等等 分子信標(biāo)（分子信標(biāo)（molecular beaconmolecular beacon）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基光基團(tuán)與標(biāo)

30、記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近團(tuán)緊緊靠近。Q-PCRQ-PCR的應(yīng)用的應(yīng)用（1 1）熒光定量）熒光定量PCRPCR數(shù)據(jù)分析，絕對(duì)定量和相對(duì)定量。數(shù)據(jù)分析，絕對(duì)定量和相對(duì)定量。 生物學(xué)家通常對(duì)下列事情感興趣：生物學(xué)家通常對(duì)下列事情感興趣：a)a)給定的血樣中的病毒顆給定的血樣中的病毒顆粒數(shù)；粒數(shù)；b)b)相當(dāng)量的腫瘤組織和正常組織比，相當(dāng)量的腫瘤組織和正常組織比，p53mRNAp53mRNA改變了多少倍。改變了多少倍。（2 2）基因表達(dá)差異分析。）基因表達(dá)差異分析。 例如：與一個(gè)生物合成途徑有關(guān)的三個(gè)基因（例如：與一個(gè)生物合成途徑有關(guān)的三個(gè)基因（A A、B B、C C），選），選擇內(nèi)參基因?yàn)閾駜?nèi)參

31、基因?yàn)?actinactin，在兩個(gè)樣本（，在兩個(gè)樣本（a a、b b）中的相對(duì)表達(dá)情況。）中的相對(duì)表達(dá)情況。 用用TaqManTaqMan探針探針 進(jìn)行多重實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增分析基因表達(dá)差異進(jìn)行多重實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增分析基因表達(dá)差異（3 3）基因型）基因型/ /等位基因分析，例如等位基因分析，例如SNPSNP檢測(cè)等檢測(cè)等（4 4）轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)）轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè) ，比如可以準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中某一種轉(zhuǎn)基，比如可以準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中某一種轉(zhuǎn)基因成分的含量。其實(shí)就是跟野生型生物相比該基因表達(dá)量因成分的含量。其實(shí)就是跟野生型生物相比該基因表達(dá)量RT-PCRRT-PCR RT-PCRRT-PCR有很高有很高的敏感性，可以的敏感

32、性，可以用來(lái)分析不同組用來(lái)分析不同組織，或是相同組織，或是相同組織不同發(fā)育階段織不同發(fā)育階段中中mRNAmRNA表達(dá)狀況表達(dá)狀況的相關(guān)性。的相關(guān)性。2022-2-924巢式巢式PCRPCR 巢式巢式PCRPCR是一種變異的聚合酶鏈反是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)(PCR)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)），使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCRPCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCRPCR引物引物擴(kuò)增片段和普通擴(kuò)增片段和普通PCRPCR相似。第二對(duì)引物相似。第二對(duì)引物稱(chēng)為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮畏Q(chēng)為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CRPCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在

33、第一次PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次物內(nèi)部，使得第二次PCRPCR擴(kuò)增片斷短于擴(kuò)增片斷短于第一次擴(kuò)增。巢式第一次擴(kuò)增。巢式PCRPCR的好處在于，如的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCRPCR的擴(kuò)的擴(kuò)增非常特異增非常特異 。一般應(yīng)用于動(dòng)物方面。如：病毒，梅毒螺旋一般應(yīng)用于動(dòng)物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，體，HIVHIV，腫瘤基因等，腫瘤基因等 巢式巢式PCRPCR，可以在，可以在10106 6基因組背景下檢測(cè)基因組背景下檢測(cè)到一個(gè)拷貝的病毒基因，所以特異性很好，到一個(gè)拷貝的病毒基因，所以特異性很好，但也是最容易污染的但也是最容易污染的PCRPCR。Touchdown PCR 用來(lái)避免非特異性序用來(lái)避免非特異性序列的擴(kuò)增列的擴(kuò)增 PCR PCR中引物的黏合溫度中引物的黏合溫度(an