高效液相色譜法分離大豆蛋白肽

1、第22卷第2期齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)Vol.22,No.22006年3月JournalofQiqiharUniversityMarch,2006高效液相色譜法分離大豆蛋白肽*盧鶴鄭永杰 摘要采用超濾以及凝膠過(guò)濾色譜法(SephadexG15分離出分子量1000以下的小肽并收集,將收集到的不同功能性目標(biāo)肽段在最佳色譜條件下進(jìn)行分離高效液相色譜凝膠過(guò)濾中圖分類(lèi)號(hào)A文章編號(hào) 分離 相對(duì)分子質(zhì)量低于1000的肽類(lèi)混合物700范圍內(nèi)無(wú)機(jī)鹽等成分 原有的肽類(lèi)也不斷被發(fā)現(xiàn)具有新的生物功能分析和制備多肽 本文采用反相高效液相色譜建立了大豆肽的RP-HPLC的分離分析方法1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑儀器包括:P230高

2、壓恒流泵EChrom98色譜工作站5um,250mm HISH水浴振蕩器 BS110S型電子天平722光 柵分光光度計(jì) 試劑與樣品Alcalase堿性蛋白酶葡聚糖凝膠G15(上海亞?wèn)|核級(jí)樹(shù)脂有限公司分析純分析純 天津科密歐科技有限公司 1.2實(shí)驗(yàn)步驟1.2.1酶水解實(shí)驗(yàn)1.2.1.1酶水解反應(yīng)配制底物濃度為6%預(yù)處理10min后 然后以加酶用量為50mL/kg 加入Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶0.1的范圍內(nèi) 1.2.1.2超濾分離收稿日期 黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 盧鶴分析化學(xué)2004級(jí)研究生 分別獲得分子量在>20000 10000 1.2.1.3凝膠過(guò)濾分離將6000以下的肽通過(guò)S

3、epHadexG15進(jìn)行分離收集分子量1000以下的肽段 取一定濃度的小肽樣品溶液進(jìn)樣至已用流動(dòng)相A液乙腈+0.1%TFA(V/V/%B液需超聲脫氣后使用然后再用相應(yīng)濃度的A液使柱平衡通常使用含TFA的水和乙腈為流動(dòng)相梯度變化速率對(duì)色譜峰形和分離度有較大影響3 為下一步采用梯度洗脫提供依據(jù)每次增加10%每次減少10%水=10 50時(shí)的分離譜圖如圖1所示 水=10水=50 進(jìn)一步設(shè)計(jì)采用不同的梯度洗脫條件進(jìn)行分離具體實(shí)驗(yàn)條件為0.1到乙腈: TFA=100:0.1,梯度方式為凸形梯度圖2樣品在凸形梯度下的分離譜圖從采用恒洗方式的各個(gè)譜圖中可以看出分別考察凹形梯度其中凸形梯度洗脫方式得到的組分第2

4、期高效液相色譜法分離大豆蛋白肽2.2流動(dòng)相中TFA濃度對(duì)分離的影響TFA是RP-HPLC分離蛋白質(zhì)和肽類(lèi)組分時(shí)最常用的緩沖試劑和離子對(duì)試劑 同時(shí)可以使鍵合硅膠填料表面殘留硅羥基質(zhì)子化TFA易揮發(fā)隨流動(dòng)相中TFA含量增加TFA含量為0時(shí) 由于TFA酸性較強(qiáng)降低色譜柱壽命分辨率 1 在分離梯度模式選擇時(shí)每次增加10%每次減少10%進(jìn)一步設(shè)計(jì)采用不同的梯度洗脫條件進(jìn)行分離具體實(shí)驗(yàn)條件為0.1到乙腈:TFA=100:0.1,梯度方式為凸形梯度 80min;進(jìn)樣量為1ml/min該法分辯率高 為下一步大量制備和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)序提供了依據(jù) AGUI L ARMI,H EARNMTW phasehighRe solutionofinsulinvariantsJ61bynarrow phaseMonitoringofrecombinanthumaninsulinproduction high performanceca