湖北漢族人群對(duì)乙肝疫苗免疫應(yīng)答的水平與HLA-I類分子多態(tài)性

1、湖北漢族人群對(duì)乙肝疫苗免疫應(yīng)答的水平與HLA-I類分子多態(tài)性的相關(guān)研究涂正坤吳雄文劉敏姜曉丹楊志章吳鋒龔非力趙修竹中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)R392.11R394.5R311.144R730.3摘要目的：探討人群對(duì)乙肝疫苗免疫應(yīng)答與HLA遺傳多態(tài)性的相關(guān)性。方法：對(duì)52名湖北漢族健康自愿者進(jìn)行HBV血源疫苗標(biāo)準(zhǔn)全程接種，共3次(第0、1、6月)，末次接種后8 w用酶免疫法(EIA)檢測(cè)血清抗HBs抗體水平：S/N2.1為應(yīng)答者；S/N2.1為無(wú)應(yīng)答者。同時(shí)對(duì)受試者進(jìn)行HLA-I類抗原多態(tài)性檢測(cè)。結(jié)果：應(yīng)答者42人(81.0%)，無(wú)應(yīng)答者10人(19.0%)；無(wú)應(yīng)答者與HLA-B39具有顯著相關(guān)性，RR17

2、.5，25.22，P0.05，而與HLA-B62呈負(fù)相關(guān)，26.41，P0.05。結(jié)論：在湖北漢族人群中，HLA-B39表型陽(yáng)性個(gè)體對(duì)乙肝疫苗免疫應(yīng)答水平明顯低于其他個(gè)體，而HLA-B62表型陽(yáng)性個(gè)體明顯高于其他個(gè)體。關(guān)鍵詞人類白細(xì)胞抗原乙肝疫苗免疫應(yīng)答Association between the feature of the immune response to hepatitis B vaccine and HLA class I polymorphism in a Hubei population of the Han nationalityTU Zheng-Kun ，WU Xiong

3、-Wen， LIU Min et al. Department of Immunology,Tongji Medical University,Wuhan 430030AbstractObjective:To study association between the feature of the immune response to hepatitis B vaccine and HLA genetic polymorphism on human.Methods:52 healthy volunteers of the Han nationality from Hubei province

4、were subjected to a standard course of immunization with HBV plasma vaccine at month 0,1 and 6 successively. 8 weeks after the last immunization,serum level of anti-HBs antibody were assayed with EIA.Individuals with S/N2.1 are responders,and S/N2.1 are nonresponders. Results:42(81.0%) of the 52 sub

5、jects were responders,10(19.0%) individuals were nonresponders.Unresponsiveness of the 10 individuals to hepatitis B vaccine were found to be positively associated with HLA-B39(RR17.5,2=5.22,P0.05) and negatively associated with HLA-B62(2=6.41,P0.05),as demonstrated by HLA-I antigen polymorphism ana

6、lysis.Conclusion:The level of immune response to hepatitis B vaccine of individuals bearing HLA-B39 antigen was significantly lower than others,individuals bearing HLA-B62 antigen was significantly higher than others.Key wordsHLAHepatitis B vaccineImmune response乙肝疫苗是取自慢性乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者血液、通過(guò)滅活并純化的乙肝表

7、面抗原(HBsAg)，它的問(wèn)世為乙型肝炎的預(yù)防提供了有力的武器，使乙型肝炎及其續(xù)發(fā)癥(慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌等)得到了有效的控制。但并非所有接種乙肝疫苗者均能免遭HBV感染，人群對(duì)乙肝疫苗的免疫應(yīng)答存在明顯的個(gè)體差異，據(jù)此可將接種人群分為應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者。影響個(gè)體對(duì)乙肝疫苗應(yīng)答能力的因素包括年齡、性別、疫苗的品牌、是否吸煙、HLA型別等，其中HLA在人類對(duì)乙肝疫苗的免疫應(yīng)答中起重要作用。研究無(wú)應(yīng)答人群的免疫遺傳學(xué)背景，將有助于進(jìn)一步完善無(wú)應(yīng)答人群的HBV預(yù)防對(duì)策，也有助于進(jìn)一步闡明人類免疫應(yīng)答基因(Ir gene)的生物學(xué)意義。本課題選擇湖北漢族人群進(jìn)行乙肝疫苗標(biāo)準(zhǔn)全程接種，觀察其應(yīng)答水

8、平，并分析該組人群HLA-I類表型頻率，以探討無(wú)應(yīng)答人群與HLA-I類抗原多態(tài)性的關(guān)聯(lián)情況。1材料與方法1.1主要材料HLA-I類分型血清板(澳大利亞皇家佩思醫(yī)院臨床免疫科Dawkins教授惠贈(zèng))可檢出HLA-A抗原特異性11種，HLA-B抗原特異性25種；血源型加熱滅活乙肝疫苗(衛(wèi)生部武漢生物制品研究所)；抗-HBs(EIA)酶免疫法試劑盒(上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司)；RPMI 1640(Gibco公司)。1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象及接種程序選擇湖北省鄂州市汀祖鎮(zhèn)王邊村52名健康自愿者進(jìn)行乙肝疫苗標(biāo)準(zhǔn)全程接種(第0、1、6月肌肉注射)，受試者年齡在1040歲之間，其中男性28名、女性24名。在全程接

9、種后8 w采集外周靜脈血標(biāo)本。1.3方法1.3.1外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離取2.5 ml全血與等量RPMI 1640培養(yǎng)液混勻，小心加在5 ml淋巴細(xì)胞分離液上，1 600 r/min離心30 min，收集單個(gè)核細(xì)胞層，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗2次，離心去上清，重新用20%FCS RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為1106個(gè)/mm3。1.3.2HLA-I類抗原分型采用國(guó)際通用的微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，在含有已知HLA-I類抗血清的反應(yīng)板中加入外周血淋巴細(xì)胞，然后加入兔補(bǔ)體，充分作用后加入染料，在倒置相差顯微鏡下判斷結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞著色且體積增大，表示待檢淋巴細(xì)胞表面具有已知抗血清

10、所針對(duì)的抗原；存活細(xì)胞不著色，透明而較小。1.3.3抗HBs抗體測(cè)定取受試者血清，借助酶免疫法(EIA)檢測(cè)抗HBs抗體水平。簡(jiǎn)言之，加入待測(cè)標(biāo)本于包被HBsAg的反應(yīng)板中，設(shè)抗HBs抗體陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各2孔，空白對(duì)照1孔，然后加酶結(jié)合物，充分混勻，孵育37 1 h，洗滌后加底物液，置37孵育15 min，然后加終止液。用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定OD492nm值，按下列公式計(jì)算并判斷結(jié)果S/N：。由于多種因素可能影響EIA檢測(cè)結(jié)果，為避免實(shí)驗(yàn)操作而致的誤差，對(duì)每份樣本連續(xù)檢測(cè)3次，取平均OD值判斷結(jié)果。S/N2.1為應(yīng)答者，S/N2.1為無(wú)應(yīng)答者。1.4統(tǒng)計(jì)處理相對(duì)危險(xiǎn)性(Relative risk

11、,RR)按Woolf公式：RR=ad/bc。a為攜帶特定HLA型別的無(wú)應(yīng)答者人數(shù)；d為不攜帶特定HLA型別的應(yīng)答者人數(shù)；b為不攜帶特定HLA型別的無(wú)應(yīng)答者人數(shù)；c為攜帶特定HLA型別的應(yīng)答者人數(shù)。四格表卡方檢驗(yàn)按公式： 。如1T5、N40，則采用校正公式：2結(jié)果52名受試者HLA-I類分型結(jié)果和抗HBs抗體水平見(jiàn)表1。52例中無(wú)應(yīng)答者為10名(19.0%)，應(yīng)答者為42名(81.0%)。HLA-I類抗原型別與乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答的相關(guān)性見(jiàn)表2。10名無(wú)應(yīng)答者中攜帶HLA-B39表型者為3人，其比例明顯高于應(yīng)答者(42人)中攜帶HLA-B39表型者(1人，2=5.22，P0.05，RR=17.5)。4

12、2名應(yīng)答者中攜帶HLA-B62表型者為14人，而10名無(wú)應(yīng)答者中無(wú)一人攜帶HLA-B62(2=6.41，P0.05)。此外，HLA-A2、A24、B16、B17、B40、B46等表型與乙肝疫苗免疫應(yīng)答無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。其他HLA型別由于在本實(shí)驗(yàn)中檢出的頻率較低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 表1湖北漢族人群52名個(gè)體HLA-I類分子多態(tài)性和抗HBs抗體水平Tab.1HLA class I phenotype and level of anti-HBs antibody in 52 individuals tested in this studySpecimen ID HLA-I phenotype Level o

13、f anti-HbsAb Specimen ID HLA-I phenotype Level of anti-HbsAb A B OD S/N A B OD S/N D409 A1 A2 B5 B62 0.49 5.76 D4371) A2 A10 B39 0.16 1.88 D4101) A2 B12 B39 0.13 1.52 D438 A2 2.69 31.64 D411 A2 3.00 35.29 D439 A10 B35 3.32 39.05 D412 A25 B53 1.60 18.82 D4411) A10 B40B17 0.13 1.52 D4131) A2A24 B16B46

14、 0.14 1.64 D442 A2A10 B40 1.37 16.11 D414 A2A10 B40B62 2.21 26.00 D443 A2A10 B46 0.19 2.23 D417 A2 B46B17 0.18 2.11 D444 A2A11 B62 0.28 3.29 D4181) A2 B16B13 0.09 1.05 D446 A11A2 B12B5 2.47 29.05 00D419 A10A24 B62 2.73 32.11 D447 A2A11 B5B46 1.78 20.94 D420 A2 2.36 27.76 D548 A2 B5 2.84 33.41 D421 B

15、5 3.32 39.05 D549 A2 B62 1.07 12.58 D4221) A33 B17 0.15 1.76 D550 A2 B16B27 0.78 9.17 D423 A10 0.44 5.17 D551 A2 B16B13 3.19 37.52 D424 A25 B7B14 1.21 14.23 D5521) A9 B39B27 0.15 1.76 D425 A2 B46 0.19 2.23 D553 A2 B13B46 2.43 28.58 D426 A2A25 B62 0.33 3.88 D554 A2 B46 0.54 6.35 D427 A33A25 B46B17 1.

16、22 14.35 D555 A2 B62 2.79 32.87 D428 A1A2 B46B62 0.42 4.94 D556 A2 B46 0.29 3.41 D429 A1A2 B7B62 0.78 9.17 D5571) A11 B5B40 0.15 1.76 D430 A10 B40 1.46 17.17 D558 A24 B40B46 3.04 35.76 D431 A28 B35 3.32 39.05 D5591) A2 B5 0.15 1.76 D4321) A24A25 B46 0.11 1.29 D560 A9 B40 0.20 2.35 D433 A2 B46 3.32 3

17、9.05 D561 A9A10 B62B40 0.32 3.76 D434 A2 B5B15 3.20 37.64 D561 A9A10 B62B40 0.32 3.76 D435 B35B12 2.19 25.76 D563 A2A33 B62 1.08 12.70 D436 A2 B62 2.58 30.35 D564 A2A33 B62 2.53 29.76 Note:1)Nonresponder,ie anti-HBs S/N2.1.The reaction to the used HLA anti-sera is negative表2乙肝疫苗應(yīng)答者與無(wú)應(yīng)答者HLA-I類表型頻率的比較

18、Tab.2Comparison of HLA class I phenotype frequencies in responders and nonresponders to hepatitis B vaccineHLA-phenotype Nonresponders Responders P B39 3 1 0.05 B62 0 14 0.05 B16 2 2 N.s B46 2 11 N.s B17 2 2 N.s B40 2 6 N.s A2 5 25 N.s A24 2 2 N.s Note:N.s:not significant3討論HLA復(fù)合體是位于人類第6號(hào)染色體短臂上的一組緊密

19、連鎖的基因群，其編碼產(chǎn)物在抗原提呈和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用；并且，HLA基因還控制人類對(duì)各種抗原的應(yīng)答能力和對(duì)疾病的易感性。已證實(shí)，小鼠對(duì)HBsAg的免疫應(yīng)答與H-2相關(guān)；H-2f和H-2s單體型表現(xiàn)為無(wú)應(yīng)答；H-2b和H-2k為中度應(yīng)答；而H-2d和H-2a為高應(yīng)答1，2。HBsAg是最早發(fā)現(xiàn)的一種在人和小鼠的免疫應(yīng)答中與MHC相關(guān)的抗原，雖然人和小鼠MHC的結(jié)構(gòu)與功能有許多共同特點(diǎn)，然而與人類免疫應(yīng)答相關(guān)的特異性MHC基因的定位，迄今尚無(wú)直接證據(jù)。其原因在于，人群為隨機(jī)婚配群體，且HLA基因系統(tǒng)具有高度多態(tài)性。盡管如此，已有許多研究者報(bào)道，人類對(duì)乙肝疫苗的免疫應(yīng)答與HLA相關(guān)。由于所研究的

20、人群不同，各家所獲得的結(jié)果不盡相同。本課題對(duì)52名健康個(gè)體進(jìn)行血源型乙肝疫苗標(biāo)準(zhǔn)全程接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者為42人(81.0%)，無(wú)應(yīng)答者為10人(19.0%)，無(wú)應(yīng)答率介于白種人群(7.0%15.0%)和日本人群(22.4%)之間3，4。此外，通過(guò)HLA多態(tài)性分析證實(shí)，無(wú)應(yīng)答者與HLA-B39表型顯著相關(guān)(RR17.5，P0.05)；無(wú)應(yīng)答與HLA-B62表型呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。本課題未觀察到其他HLA-I類表型與乙肝疫苗免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)。在本實(shí)驗(yàn)中，人群對(duì)乙肝疫苗的免疫應(yīng)答與年齡、性別無(wú)關(guān)。在日本人群中，乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者與HLA-Bw54、DR4、DRw53表型具有極強(qiáng)相關(guān)性，RR值分別為5

21、.47、2.57和15.934，但未發(fā)現(xiàn)HLA與HBsAg高應(yīng)答存在關(guān)聯(lián)5。在白種人群中，攜帶HLA-DR3、-DR7表型或攜帶擴(kuò)展單體型HLA-B8-SC91-DR3、HLA-B44-Fe31-DR7的個(gè)體無(wú)應(yīng)答率極高6，7；而HLA-DR1與HBsAg高應(yīng)答相關(guān)8。上述結(jié)果與本課題所獲結(jié)果不同，其原因可能是由于不同人群遺傳背景存在差異，從而與HBsAg無(wú)應(yīng)答關(guān)聯(lián)的HLA表型亦不同。涂正坤現(xiàn)在廣州市婦嬰醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所，廣州510180作者簡(jiǎn)介：涂正坤，男，33歲，免疫遺傳學(xué)專業(yè)碩士生；指導(dǎo)教師，龔非力，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫和免疫遺傳學(xué)研究作者單位：(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教

22、研室，武漢430030)4參考文獻(xiàn)1Milich D R,Leroux-Roels G G,Chisari I V.Genetic regulation of the immune response to the hepatitis B surface antigen (HBsAg) ，qualiative characteristic of the humoral immune response to the a，d and y determinates of HBsAg .J Immunol,1983;130:13952Milich D R， Leroux-Roels G G,louie

23、R E et al Genetic regulation of the immune response to the hepatitis B surface antigen(HBsAg)IV，distinct H-2-linked Ir gene control antibody response to different HBsAg determinates on the same molecule and map to the I-A and I-C subregions.J Exp Med,1984;159:413Nowicki M J， Tong M J， Bohman R E. Alterations in the immune response in nonresponders to the hepatitis B vaccine. J Infect Dis,1985;152:12454Watanabe H， Matsushita