葡萄糖濃度對(duì)大腸桿菌發(fā)酵L_色氨酸的影響_圖文

1、葡萄糖濃度對(duì)大腸桿菌發(fā)酵L 2色氨酸的影響3程立坤1,趙春光2,黃靜1,徐慶陽(yáng)1,謝希賢1,陳寧11(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津,3004572(河南巨龍淀粉實(shí)業(yè)有限公司,河南汝州,467500摘要利用30L 自控發(fā)酵罐研究了大腸桿菌TRJT H0709產(chǎn)L 2色氨酸的發(fā)酵工藝。考察了初始葡萄糖濃度和發(fā)酵過程中葡萄糖維持濃度對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率、質(zhì)粒穩(wěn)定性、乙酸含量、菌體生物量及L 2色氨酸產(chǎn)量的影響。最終確定:初始葡萄糖濃度為20g/L ,葡萄糖維持濃度采用葡萄糖限制流加培養(yǎng)方式。根據(jù)溶氧響應(yīng)信號(hào)的特征反饋控制葡萄糖的流加速率,可將菌體比生長(zhǎng)速率控制在較低水平,有效地減少了發(fā)酵過程中乙酸的產(chǎn)

2、生及提高了質(zhì)粒穩(wěn)定性,實(shí)現(xiàn)了重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng),菌體生物量和L 2色氨酸分別為50121g/L 和33150g/L 。關(guān)鍵詞大腸桿菌,L 2色氨酸,葡萄糖限制第一作者:碩士研究生(陳寧教授為通訊作者。3國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題(No .2008Z X09401-05;“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No .2008BA I 63B01收稿日期:2010-01-21L 2色氨酸(L 2tryp t ophan 的化學(xué)名稱為2氨基22吲哚基丙酸,是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)中八種必需氨基酸之一,對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用,被稱為第二必需氨基酸,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和

3、飼料等方面1。目前利用微生物生產(chǎn)L 2色氨酸的方法主要有酶法、微生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法2,其中微生物發(fā)酵法是大規(guī)模生產(chǎn)L 2色氨酸的首選技術(shù)。微生物發(fā)酵法以通過代謝工程手段構(gòu)建的重組菌為生產(chǎn)菌種,采用高密度培養(yǎng)技術(shù),為色氨酸產(chǎn)品開發(fā)開辟了新的生產(chǎn)途徑,現(xiàn)常用菌株有大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌。由于大腸桿菌具有遺傳特性較清楚、易培養(yǎng)、發(fā)酵周期短并能實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)等特性,因而重組大腸桿菌得到廣泛地應(yīng)用3。實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵,可相應(yīng)縮小生物反應(yīng)器的體積和降低生物量的分離費(fèi)用,從而降低生產(chǎn)成本,達(dá)到提高生產(chǎn)效率的目的。優(yōu)化碳源是重組大腸桿菌高密度、高表達(dá)發(fā)酵控制中的關(guān)鍵因素。由于細(xì)菌利用

4、葡萄糖生長(zhǎng)速度快,且測(cè)定方便,葡萄糖成為大腸桿菌發(fā)酵中最常用的碳源4。但培養(yǎng)基中高濃度的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致乙酸等代謝副產(chǎn)物的生成,對(duì)發(fā)酵不利,因此培養(yǎng)基中合適的葡萄糖濃度有利于實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵,取得良好的發(fā)酵效果。文中通過考察初始葡萄糖濃度及發(fā)酵過程中葡萄糖的維持濃度對(duì)L 2色氨酸發(fā)酵的影響,確定了合適的葡萄糖初始濃度及采用葡萄糖限制流加方式控制發(fā)酵過程中葡萄糖的維持濃度,使L 2色氨酸產(chǎn)量和生物量得到顯著提高。1材料與方法111實(shí)驗(yàn)材料11111菌株大腸桿菌TRJH0709(tr pEDCBA +tet R,天津科技大學(xué)工業(yè)微生物菌種保藏室提供。11112培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g/L :葡

5、萄糖20,酵母膏15,(NH 42S O 410,檸檬酸鈉015,MgS O 47H 2O 5,KH 2P O 4115,FeS O 47H 2O 15mg,V B1100mg,四環(huán)素50mg,pH 710-712,0175×105Pa 滅菌15m in 。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L :葡萄糖20,酵母膏1,(NH 42S O 44,檸檬酸鈉2,MgS O 47H 2O 5,K H 2P O 42,FeS O 47H 2O 100mg,pH 710-712,0175×105Pa 滅菌15min 。11113主要儀器發(fā)酵罐(10L 、30L 全自動(dòng)發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司

6、;生物傳感儀(S BA -40C,山東科學(xué)院生物研究所;pH 電極(METT LER T OLE 2DO ;溶氧電極(METT LER T OLE DO ;高效液相色譜儀(Agilent 1200,Agilent Technol ogies ;真空干燥箱(DZF -6020,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;電子天平(F A2204B ,上海精密科學(xué)儀器有限公司。112培養(yǎng)方法種子培養(yǎng):吸取適量無菌生理鹽水于5支活化斜面中,將所有菌懸液接入裝10L 種子罐中;初始通氣量1L /m in;攪拌轉(zhuǎn)速300-700r/m in;通過自動(dòng)流加氨水控制pH 在710;培養(yǎng)溫度32;以泡敵消泡;培養(yǎng)8h 后,按10%

7、接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng):按10%接種量將種子液接入30L 發(fā)酵罐中;初始通氣量2L /m in;攪拌轉(zhuǎn)速500-800r/m in;通過自動(dòng)流加氨水控制pH 在710;培養(yǎng)溫度32;以泡敵消泡;發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降至一定值時(shí),將80%葡萄糖溶液以一定的脈沖速度流加至培養(yǎng)基中以維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在所需的濃度范圍。113分析方法菌體生物量:菌體生物量以菌體干重表示,取10mL 發(fā)酵液,10000r/m in 離心20m in,將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中80干燥至恒重,用分析天平稱重。質(zhì)粒穩(wěn)定性的測(cè)定5:將發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后涂布于不含四環(huán)素的LB 平板上,于37

8、培養(yǎng)24h 后,挑取100個(gè)單菌落復(fù)制到含有四環(huán)素的LB 平板上,37培養(yǎng)24h 后,通過計(jì)算含質(zhì)粒細(xì)胞所占的百分率來確定質(zhì)粒穩(wěn)定性。溶氧及pH:在線測(cè)定。葡萄糖濃度:采用生物傳感儀測(cè)定。L 2色氨酸、乙酸濃度:L 2色氨酸含量采用高效液相分析系統(tǒng)測(cè)定,色譜分離條件:Agilent C 18(150mm ×416mm ,315m ,流動(dòng)相V (0103%KH 2P O 4溶液V (甲醇=9010,流速1mL /m in,檢測(cè)波長(zhǎng)278n m;乙酸濃度測(cè)定采用RP 2HP LC 6。114數(shù)據(jù)處理發(fā)酵過程中菌體比生長(zhǎng)速率根據(jù)公式7:=1X d xd t用O rigin 繪圖軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)

9、據(jù)進(jìn)行微分計(jì)算,再用Excel 軟件求解不同時(shí)刻的。其中X 、x 均為菌體量(g/L ,t 為時(shí)間(h ,為每克菌體在1h 內(nèi)菌體增加的質(zhì)量(g ,的單位為h -1。2結(jié)果與討論211初始葡萄糖濃度的確定L 2色氨酸發(fā)酵初期,葡萄糖供給充足,細(xì)菌的呼吸比較旺盛。大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L 2色氨酸時(shí),高濃度葡萄糖條件下會(huì)發(fā)生“Crabtree ”效應(yīng)而產(chǎn)生乙酸8。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度嚴(yán)重影響大腸桿菌的代謝方式,當(dāng)葡萄糖供給量高于細(xì)胞所能同化的速率時(shí),細(xì)胞比生長(zhǎng)速率過大9。當(dāng)比生長(zhǎng)速率超過一定限度,三羧酸循環(huán)達(dá)到飽和時(shí),即使在供氧充足條件下,細(xì)菌體內(nèi)的丙酮酸也會(huì)通過磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶(Pta 2Ac

10、k 途徑,生成乙酸排出體外,導(dǎo)致培養(yǎng)基中乙酸的積累10;培養(yǎng)基中高濃度乙酸反過來會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng),降低比生長(zhǎng)速率。同時(shí),Engberg 11等研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)速率增大,質(zhì)粒的穩(wěn)定性下降,認(rèn)為高比生長(zhǎng)速率下,質(zhì)粒的復(fù)制速率跟不上細(xì)胞的分裂速率。發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度分別為10g/L 、20g/L 、30g/L 、40g/L,當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降至一定值時(shí),通過流加80%葡萄糖溶液使發(fā)酵液中葡萄糖濃度維持在5g/L,進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵,結(jié)果如圖1所示。A:菌體比生長(zhǎng)速率;B:質(zhì)粒穩(wěn)定性及乙酸含量;C:生物量;D:L 2色氨酸產(chǎn)量圖1初始葡萄糖濃度對(duì)L 2色氨酸發(fā)酵的影響(注:圖12B 中實(shí)心圖標(biāo)為質(zhì)

11、粒穩(wěn)定性;空心圖標(biāo)為乙酸濃度。下同。由圖1可知,采用20g/L 初始葡萄糖濃度時(shí),菌體比生長(zhǎng)速率較低,乙酸含量低,質(zhì)粒穩(wěn)定性高,同時(shí)L 2色氨酸產(chǎn)量和菌體生物量均較高。初始葡萄糖濃度為10g/L 時(shí),發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)較快,產(chǎn)酸也較快,但高比生長(zhǎng)速率導(dǎo)致乙酸增多、質(zhì)粒穩(wěn)定性下降,同時(shí)進(jìn)入主發(fā)酵期菌體增長(zhǎng)無力,活力下降,導(dǎo)致產(chǎn)酸水平低;采用高濃度初糖發(fā)酵,菌體前期生長(zhǎng)受到抑制,且“葡萄糖效應(yīng)”也導(dǎo)致乙酸大量積累,高濃度的乙酸反過來抑制了菌體的生長(zhǎng),L 2色氨酸產(chǎn)量較低。因此,過低或過高的初糖濃度都不利于菌體產(chǎn)酸,合適的初糖濃度(20g/L 可有效減少發(fā)酵過程中乙酸含量,提高質(zhì)粒穩(wěn)定性,同時(shí)有利于提

12、高產(chǎn)酸水平和菌體生物量。212葡萄糖維持濃度的確定培養(yǎng)基中初始葡萄糖耗盡后,控制葡萄糖的流加速率,使菌體比生長(zhǎng)速率和發(fā)酵中葡萄糖濃度控制在一定的閥值內(nèi),可避免乙酸的產(chǎn)生且提高菌體的質(zhì)粒穩(wěn)定性。當(dāng)L 2色氨酸生產(chǎn)菌的比攝糖速率超過一定的臨界值時(shí),即使在氧充足條件下E 1coli 也會(huì)發(fā)生“Crabtree ”效應(yīng)抑制菌體生長(zhǎng)及對(duì)代謝過程產(chǎn)生不利影響?？刂破咸烟堑臄z入速率略低于或等于T CA 循環(huán)的周轉(zhuǎn)能力,可有效避免中間產(chǎn)物乙酰輔酶A 通過乙酰磷酸途徑產(chǎn)生乙酸10;同時(shí)控制葡萄糖的攝入速率可將菌體比生長(zhǎng)速率維持在較低水平。因此維持發(fā)酵過程中合適的葡萄糖濃度可有效地減少乙酸的生成及提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。

13、發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為20g/L,當(dāng)葡萄糖濃度將到一定值時(shí),通過限制流加80%葡萄糖溶液,分別維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為2g/L 、5g/L 、10g/L 和15g/L,結(jié)果見圖2 。A:菌體比生長(zhǎng)速率;B:質(zhì)粒穩(wěn)定性及乙酸含量;C:生物量;D:L 2色氨酸產(chǎn)量圖2葡萄糖維持濃度對(duì)L 2色氨酸發(fā)酵的影響由2可知,維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為2g/L時(shí),菌體比生長(zhǎng)速率較小,質(zhì)粒穩(wěn)定性高,乙酸生成量少,生物量和L 2色氨酸產(chǎn)量均最高;葡萄糖濃度高于5g/L 時(shí),葡萄糖供應(yīng)充足,菌體比生長(zhǎng)速率大,生成的乙酸較多,同時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定性較差,對(duì)產(chǎn)物合成和菌體生物量均不利,因此所得到的發(fā)酵效果差。由以上可知,維

14、持發(fā)酵過程中較低的葡萄糖濃度既可維持較低的比生長(zhǎng)速率,提高菌體質(zhì)粒穩(wěn)定性,又可以有效減少副產(chǎn)物乙酸的生成。Akess on 等12利用標(biāo)準(zhǔn)溶氧電極和補(bǔ)料過程中施加脈沖相結(jié)合的技術(shù)來識(shí)別補(bǔ)料分批發(fā)酵過程乙酸的產(chǎn)生,并反饋控制底物的流加速率,既實(shí)現(xiàn)了葡萄糖限制培養(yǎng)發(fā)酵,又避免了乙酸的產(chǎn)生。213葡萄糖限制培養(yǎng)的應(yīng)用在葡萄糖限制培養(yǎng)的條件下,脈沖補(bǔ)入的葡萄糖使大腸桿菌的比攝糖速率增加,當(dāng)比攝糖速率低于臨界值時(shí),大腸桿菌的比攝氧速率也隨之升高,這種變化可通過DO 值的降低顯示出來。而脈沖過后,隨著葡萄糖濃度的下降,比攝糖速率也下降,DO 值逐漸回升。但當(dāng)脈沖補(bǔ)入的葡萄糖過多,大腸桿菌的攝糖速率超過臨界

15、值時(shí),即超過TCA 循環(huán)的周轉(zhuǎn)能力時(shí),涌向T CA 循環(huán)的代謝流向乙酰磷酸途徑溢流而產(chǎn)生乙酸,攝氧能力處于飽和狀態(tài),同時(shí)DO 值不會(huì)隨著葡萄糖的脈沖補(bǔ)入而產(chǎn)生振蕩變化。因此,根據(jù)DO 值對(duì)葡萄糖脈沖補(bǔ)入產(chǎn)生信號(hào)的不同可為在線調(diào)整補(bǔ)料速率提供直接的依據(jù)13,且達(dá)到了葡萄糖限制培養(yǎng)的目的。以初始葡萄糖濃度20g/L 進(jìn)行分批發(fā) 酵試驗(yàn),但初始葡萄糖耗盡時(shí),根據(jù)DO 值的振蕩變化來調(diào)節(jié)80%葡萄糖溶液的補(bǔ)料速率,發(fā)酵過程曲線如圖3所示。圖3葡萄糖限制培養(yǎng)條件下L 2色氨酸發(fā)酵過程曲線由圖3可知,發(fā)酵前期,由于初始葡萄糖的存在,隨著菌體生長(zhǎng),對(duì)氧的需求逐漸增大,則通過調(diào)節(jié)攪拌速率將溶氧維持在20%左右

16、。但發(fā)酵至5h 時(shí),溶氧值迅速回升,發(fā)酵液中葡萄糖濃度為0g/L,此時(shí)開始補(bǔ)料,則利用DO 值的回升變化可以判定補(bǔ)料的時(shí)機(jī)。根據(jù)菌體生長(zhǎng)耗糖速率及對(duì)氧需求的變化,調(diào)整補(bǔ)料速率和攪拌轉(zhuǎn)速,可將發(fā)酵過程中葡萄糖供給處于限制水平及DO 值分別維持在15%左右。這不僅使葡萄糖的流加速率最大限度地滿足菌體生長(zhǎng)的需要,還可以滿足菌體生長(zhǎng)對(duì)氧的需求。據(jù)Maje wski 等14研究報(bào)道,在補(bǔ)料分批培養(yǎng)重組大腸桿菌的過程中產(chǎn)生乙酸的原因主要有2個(gè),即設(shè)備的供氧能力不足使得重組菌的呼吸受到限制和葡萄糖的攝入速率大于重組菌T CA 循環(huán)的周轉(zhuǎn)能力。因此,葡萄糖限制培養(yǎng)發(fā)酵可有效減少發(fā)酵過程中乙酸的生成。葡萄糖限制

17、培養(yǎng)條件下L 2色氨酸分批補(bǔ)料發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,葡萄糖限制培養(yǎng)條件下進(jìn)行L 2色氨酸發(fā)酵時(shí),可將max 控制在0122h -1以下,質(zhì)粒穩(wěn)定性高。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溶氧電極和脈沖補(bǔ)料技術(shù)可有效減少重組大腸桿菌發(fā)酵過程中乙酸的生成,發(fā)酵液中乙酸含量?jī)H為017g/L,同時(shí)取得了良好的發(fā)酵效果 ,菌體生物量和L 2色氨酸產(chǎn)量分別高達(dá)50121g/L 和33150g/L 。圖4葡萄糖限制培養(yǎng)對(duì)L 2色氨酸發(fā)酵的影響3討論重組大腸桿菌高密度發(fā)酵成功的關(guān)鍵技術(shù)是補(bǔ)料策略,即根據(jù)重組菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)及產(chǎn)物的表達(dá)方式采取合理的營(yíng)養(yǎng)物流加方式。葡萄糖已廣泛用作重組菌發(fā)酵的限制性基質(zhì),但大腸桿菌在過量葡萄糖

18、或缺氧的條件下會(huì)發(fā)生“葡萄糖效應(yīng)”,積累大量乙酸等副產(chǎn)物而影響菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成。因此,大腸桿菌高密度發(fā)酵中合理流加碳源使“葡萄糖效應(yīng)”降低,是成功的關(guān)鍵。發(fā)酵過程中葡萄糖濃度會(huì)影響菌體比生長(zhǎng)速率,比生長(zhǎng)速率是一個(gè)重要的參數(shù),它能影響質(zhì)粒穩(wěn)定性,與重組蛋白的表達(dá)量、乙酸等生長(zhǎng)抑制性副產(chǎn)物的形成有很大關(guān)系。細(xì)胞以低比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)時(shí),質(zhì)粒的復(fù)制有更充裕的時(shí)間,有利于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。Han 10等認(rèn)為細(xì)菌在低比生長(zhǎng)速率條件下通過氧化代謝作用產(chǎn)生的能力足以滿足合成和異化作用的需求,不會(huì)產(chǎn)生乙酸,而在高比生長(zhǎng)速率時(shí),大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提高足夠的能量,必須通過乙酸生成途徑儲(chǔ)備ATP 和NADH 2。

19、葡萄糖濃度過高時(shí),也會(huì)引起大量乙酸的積累。高濃度的乙酸反過來會(huì)降低菌體的比生長(zhǎng)速率。高量等研究報(bào)道15,在葡萄糖限制流加培養(yǎng)過程中,高親和系統(tǒng)被激活,細(xì)胞對(duì)葡萄糖的親和性增強(qiáng),為細(xì)胞高效利用葡萄糖創(chuàng)造了條件。因此,控制發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度,可有效地減少乙酸的產(chǎn)生,提高質(zhì)粒穩(wěn)定性,有利于獲得良好的發(fā)酵效果。應(yīng)用溶氧反饋控制補(bǔ)料不僅可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖限制培養(yǎng)發(fā)酵,還可以滿足菌體生長(zhǎng)對(duì)氧的需求。底物限制流加培養(yǎng)方式具有可以根據(jù)細(xì)胞的需求補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、減少相應(yīng)副產(chǎn)物生產(chǎn),使環(huán)境較為穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)16,因此可以解決因葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一次性投入,造成乳酸等代謝副產(chǎn)物大量積累及細(xì)胞能量利用效率低下的問題。若大腸桿

20、菌攝入的底物過多,比生長(zhǎng)速率大于一定的閥值后易積累乙酸17。較低的葡萄糖濃度,不但將菌體比生長(zhǎng)速率控制在較低水平,有利于減少乙酸的生成,提高質(zhì)粒穩(wěn)定性,而且可以避免“葡萄糖效應(yīng)”的發(fā)生。在L2色氨酸發(fā)酵過程中,利用葡萄糖限制培養(yǎng)發(fā)酵取得了良好的發(fā)酵效果,但是在發(fā)酵過程中仍有乙酸的生成而對(duì)發(fā)酵不利。溶氧反饋補(bǔ)料技術(shù)可以與其他合適的補(bǔ)料方案結(jié)合運(yùn)用而不相沖突,既可以監(jiān)控補(bǔ)料過程,又有利于產(chǎn)物表達(dá)的優(yōu)化控制。參考文獻(xiàn)1趙春光,程立坤,徐慶陽(yáng),等.微生物法生產(chǎn)L2色氨酸的研究進(jìn)展J.發(fā)酵科技通訊,2008,37(4:34-36. 2Charles Yanofsky.U sing studies on

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