環(huán)境微生物群落分析的T_RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施

1、應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報2006,12(6:861868Ch i n J App lE n vi ron B i o l=ISSN10062687X2006212225環(huán)境微生物群落分析的T2RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施*余素林吳曉磊*錢易(清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系/環(huán)境模擬與污染控制國家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室北京100084摘要末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(ter m i na l restr i ctio n frag m ent length poly m orphis m,T2R FLP是近年來發(fā)展起來的、不依賴于培養(yǎng)的微生物群落分析方法之一.由于其在微生物群落結(jié)構(gòu)分析方面的特點(diǎn),包括分辨率高、易于

2、實(shí)現(xiàn)自動化及互聯(lián)網(wǎng)海量數(shù)據(jù)共享等優(yōu)勢,自1997年最先被報道以來得到了廣泛的應(yīng)用,成為環(huán)境微生物群落分析的最強(qiáng)有力的工具之一.本文詳細(xì)介紹了T2R FLP技術(shù)的原理,并從環(huán)境樣品群落D NA的提取、引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增、限制性酶切、電泳分離檢測和T2RFLP圖譜解析等5個方面討論了用該技術(shù)解析環(huán)境微生物群落的方法和技巧,簡述了近8a來國外T2RFLP技術(shù)在群落分析中的研究進(jìn)展.類似于其他的分子微生物生態(tài)學(xué)技術(shù),T2R FLP也有自身的缺陷,因此重點(diǎn)分析了該技術(shù)的局限性及相應(yīng)的解決辦法.圖2表1參62關(guān)鍵詞微生物群落;末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T2RFLP;分子微生物生態(tài)學(xué);生物多樣性CLC

3、 X172App lication and O p ti m ization of T2R FLP M ethod forM icrob i a l C o mm un ity Ana l ysis*YU Suli n,WU X i a ole i*&Q I A N Y i(S t a t eK e y J oi n t Labora tory of E nvironm ent Si mu l a tion and P oll u tion Control,De part men t of E nvironm e n t Science and Eng i n ee ring,T s

4、inghua Un i versit y,Beiji ng100084,Ch i n aAbstr a ct Te r m i na l restricti on frag m ent l ength pol y morph is m(T2RFLPanalysis is a cultur i ng2independent approach for ana l yzing m icrobia l co mmunity i n envi ron m ents.It has been pro ved to be po werful and wide l y app lied si nce deve

5、l oped i n1997. The pri nc i p l e and genera l procedure of the T2R FLP techn i que for the ana l ysis ofm icrob i a l co mm un ity are discussed i n deta i,l i ncl uding D NA extracti on of enviro n m enta l samp l es,a m plifi cati on of genes encodi ng the16S rRNA,18S rRN A or enzy m esw it h fl

6、 uorescen tly labeled pr i m ers,t he restrictio n enzy m e d i gesti on of PCR pro ducts,cap illary electrophores i s and the analysis of T2 RFLP profil e.A brief revie w i s a lsom ade o n the research ofm icrob i a l co mmunityw ith the T2R FLP technique i n recent8yea rs.A s with othe r PCR2base

7、d molecu l a r techn i ques,the T2RFLP is not free of pitfalls.The li m i ts of t he T2RFLP approach are also su mm ar ized as well as the ir possi b le sol uti ons i n this paper.In add ition,so m e va l uab l e web reso urces are introduced for a bet2 ter understandi ng and hand ling of T2RFLP m e

8、thod.W i th the advantages of hi gh sensiti vity,si m pli c ity for auto m atizati on and a2 vail ability to share t he substantive data o n In ternet,t he T2RFLP is no wadays one of the most po werf u l to ols f or ana lyzi ngm i cro2 b i a l co mmun ity.F i g2,Tab1,R ef62K eyword s m icrob i a l c

9、o mm un it y ana l ysis;T2RFLP;molecu l ar m icro b i a l ecology;m i cro b ial diversityCLC X172環(huán)境中的微生物都不是單獨(dú)存在的,總是通過各種信號轉(zhuǎn)遞、對空間和營養(yǎng)的相互競爭和依賴等作用而形成微生物群落.分析微生物的群落結(jié)構(gòu),了解微生物與環(huán)境的相互作用關(guān)系,有助于從種群和群落水平上深入理解環(huán)境中的微生物過程和微生物群落的進(jìn)化和演替,了解環(huán)境污染物遷移轉(zhuǎn)化的微生物學(xué)基礎(chǔ),更深刻地認(rèn)識各種生物處理工藝的微觀機(jī)理,從而為調(diào)控和優(yōu)化微生物群落、提高處理效果、研究開發(fā)新型高效的環(huán)境生物修復(fù)工藝和處理技術(shù)提供理

10、論指導(dǎo).收稿日期:2005206223接受日期:2005208202*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30300008和國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃資助項(xiàng)目(N o.2005CB221308Supported by t h e Nati onalN atural Sci en ce Found ati on of Ch i na(No.30300008and t h e State Key Basic R&D Progra m of Ch i na(No.2005CB221308*通訊作者Corres pond i ng au t hor(E2M ai:l x i ao l e

11、i_wum a i.l ts i ng2 傳統(tǒng)的微生物群落分析方法建立在微生物分離、純種培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,通過對純種微生物進(jìn)行顯微觀察和生理生化特性研究來認(rèn)識群落結(jié)構(gòu).由于環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,物種多樣性極高,純種分離富集培養(yǎng)的方法不但費(fèi)時費(fèi)力,而且存在致命的方法學(xué)上的缺陷:¹自然界大量微生物的不可培養(yǎng)性,使人類無法培養(yǎng)自然界中所有的微生物1,2;º分離富集培養(yǎng)方法具有強(qiáng)烈的選擇性,使培養(yǎng)得到的微生物在種類、數(shù)量和功能上都無法反映自然狀態(tài)下微生物群落的真實(shí)情況3.所以,很有必要研究不依賴微生物培養(yǎng)來進(jìn)行環(huán)境微生物群落分析的方法.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,自從1986年P(guān)

12、ace等人利用核酸序列分析技術(shù)研究微生物的生態(tài)和進(jìn)化以來,分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析,研究方法也層出不窮,包括:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poly m erase chain reac tio n,PCR4,5、基因克隆文庫分析法(gene c l oning library,GCL6,7、熒光原位雜交法(fl uorescence in sit u hybri d izati on ,F IS H 811、限制性酶切片段長度多態(tài)性分析法(restr i c ti on frag m en t lengt h poly m orph i s m,RFLP 12、變性梯度凝膠電泳法(

13、dena t ur i ng grad i ent ge l e lectro phoresis ,DGGE13和溫度梯度凝膠電泳法(t her m a l gradient ge l e lectro phoresis ,TGGE 14等等,并且發(fā)展了/分子微生物生態(tài)學(xué)0這門新興的學(xué)科.這些新興方法和學(xué)科有助于突破傳統(tǒng)認(rèn)識方法的制約,為人類較為準(zhǔn)確地認(rèn)識自然界中微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能、進(jìn)化和演替等等提供嶄新的視野和強(qiáng)有力的手段.本文介紹的末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(ter m i 2nal restricti on frag m ent length pol y morph i s m

14、,T 2RFLP 就是在PCR 技術(shù)和RFLP 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的微生物群落分析的最新技術(shù).這種技術(shù)克服了基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法的局限性,相對于其它分子生物學(xué)分析技術(shù)如RFLP 、DGGE 或T GGE 等,它具有分辨率高、易于實(shí)現(xiàn)自動化等特點(diǎn),還可以將微生物群落分析同核糖體數(shù)據(jù)庫計(jì)劃(r i boso m a l database project ,RDP 相結(jié)合,充分利用互聯(lián)網(wǎng)海量數(shù)據(jù)資源共享的優(yōu)勢.1997年以來的大量研究實(shí)踐表明,T 2RFLP 技術(shù)是分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落的最強(qiáng)有力的工具之一1520.1 T 2RFLP 技術(shù)的基本原理T 2R FLP 技術(shù)以分子系統(tǒng)學(xué)的原理為基礎(chǔ),綜合

15、運(yùn)用了PCR 技術(shù)、DNA 限制性酶切技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)和D NA 序列自動分析技術(shù),在DNA 水平上通過對特定核酸片段長度多態(tài)性的測定來分析比較微生物群落結(jié)構(gòu)和功能.用T 2RFLP 技術(shù)分析微生物群落,首先根據(jù)比較基因組學(xué)的原理選取一段具有系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記特征的DN A 序列作為目標(biāo)分析序列.從原理上講,微生物群落中任何具有特異性的D NA 片段都可以作為目標(biāo)分析序列,包括微生物核糖體小亞基(SS U 16S rRNA (原核生物和18S r RN A (真核生物的基因序列(即16S r DNA 和18S r DNA21;產(chǎn)甲烷古菌的編碼甲基輔酶M 還原酶(m ethyl coenzy m e

16、 2M reductase ,MCR 的mcr A 基因序列、編碼氨單加氧酶(a mm onia m onooxygenase ,A MO 的amo A 基因序列、編碼反硝化細(xì)菌特有的氧化亞氮還原酶(n i 2tro us oxide reductasenos Z 基因序列等等.由于微生物16S r D 2NA 和18S rD NA 在系統(tǒng)分類學(xué)和進(jìn)化研究中的特殊地位22,16S rD NA 和18S r DN A 是最常用的微生物群落結(jié)構(gòu)分析的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子,但是微生物功能基因的特異性保守序列也日益得到重視和被廣泛采用.利用T 2RFLP 分析微生物群落時,首先根據(jù)微生物群落的特點(diǎn)以及分析

17、目的確定目標(biāo)DNA 片段,根據(jù)目標(biāo)基因序列上的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對合適的引物,其中一個引物的5c 端用熒光物質(zhì)標(biāo)記.采集樣品,提取樣品中微生物群落的總D NA ,以總D NA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng),擴(kuò)增得到各種微生物目標(biāo)D NA 片段的一端就帶有熒光標(biāo)記.利用合適的限制性內(nèi)切酶對PCR 擴(kuò)增的D NA 片段進(jìn)行消化,不同微生物目標(biāo)D NA 片段因其核苷酸序列不同會導(dǎo)致酶切位點(diǎn)存在差異,于是酶切后產(chǎn)生許多長度不同的限制性片段.利用D NA 測序儀對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離和熒光檢測,只有末端帶熒光標(biāo)記的片段(ter m ina l re 2stricti on frag m ent ,T 2RF 或者

18、稱為操作分類單元(operatio na l taxo no m ic unit ,OT U 才會被檢測到,而其他沒有帶熒光標(biāo)記的片段則不被檢測.由于核苷酸序列具有多態(tài)性,也就是說不同微生物的同一個基因的核苷酸序列存在差異,所以同一個基因的D NA 片段在相同的酶切后可能得到長度不同的T 2RF ,反映在T 2RFLP 檢測中就是不同的熒光信號.通過對這些熒光信號以及由此生成的T 2RFLP 圖譜的分析,就可以揭示樣品中微生物的種類、數(shù)量和種群大小等,從而解析微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能及其動態(tài)變化.2 T 2RFLP 技術(shù)分析微生物群落的步驟T 2RFLP 技術(shù)分析微生物群落的整個流程可以用圖1表

19、示,以下對每一操作步驟進(jìn)行較為詳細(xì)的介紹 .圖1 T 2RFLP 法分析微生物群落結(jié)構(gòu)流程圖F i g .1 Procedu re ofT 2RFLP m et hod t o anal yze m icrob i al co m m un i ty2.1 環(huán)境樣品的采集、預(yù)處理和群落總DN A 的提取T 2R FLP 技術(shù)分析的微生物群落可以來自土壤2,6,7,15、水體51、河流底泥8,37或各種人工構(gòu)建的生物處理工藝14,44,45.不同的采樣和預(yù)處理方法對DNA 提取、擴(kuò)增和分析都會產(chǎn)生重大影響23,24,所以要根據(jù)不同的環(huán)境樣品和分析目的來制定相應(yīng)的采樣方案和運(yùn)輸保存方法,防止在樣品

20、采862 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報 Ch i n J App lE n vi ron B i o l 12卷集和運(yùn)輸過程中因溶菌作用造成核酸損失.采集的環(huán)境樣品可用冰塊冷凍保存盡快送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析、保藏或其它預(yù)處理;也可用其他方式處理,例如Conrad課題組研究稻田土壤中產(chǎn)甲烷古菌群落,在意大利采集稻田土壤,1d內(nèi)室溫下運(yùn)送到德國,干燥后在4e和室溫下進(jìn)行保存62.環(huán)境樣品總DN A的提取是T2RFLP技術(shù)的關(guān)鍵之一. DNA提取法應(yīng)盡可能地提取樣品中所有微生物的完整的D NA 分子,使之能夠代表樣品中的遺傳多樣性的實(shí)際情況.關(guān)于群落總D NA的提取方法已經(jīng)有很多研究和報道,不同方法具有各自的背景

21、和特點(diǎn)2530.由于實(shí)際操作中很難保證對所有微生物的完整DNA分子進(jìn)行提取,所以必須根據(jù)T2RFLP分析的目的來選取DNA提取方法.例如,解析微生物群落結(jié)構(gòu)的T2 R FLP分析,D NA提取法就應(yīng)該將提高D NA提取效率作為重點(diǎn),充分考慮對種群比較小、細(xì)胞難以破碎的微生物DN A的提取,盡可能提取最多種類的微生物DN A;如果重點(diǎn)要研究微生物群落中占優(yōu)勢的微生物種群大小以及功能,則應(yīng)該著重考慮DNA分子的完整性.總之應(yīng)根據(jù)研究目的和具體樣品等實(shí)際情況,對微生物群落總DNA的提取方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,找出最適宜的D NA提取方法,保證后續(xù)的T2RFLP的準(zhǔn)確性.2.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增要根據(jù)所研

22、究的微生物菌群的具體情況設(shè)計(jì)引物.對于細(xì)菌或古菌,根據(jù)其16S rD NA上的某些保守區(qū)域來設(shè)計(jì)通用型引物,可以用來擴(kuò)增環(huán)境樣品中大部分真細(xì)菌和古菌.對于真核微生物,相應(yīng)的分類進(jìn)化分子標(biāo)記是18S rD NA,同樣可以設(shè)計(jì)出擴(kuò)增群落中大部分真菌的通用引物.同理,通過對某個綱、某個科或某個目內(nèi)16S r DNA序列的認(rèn)識,可以針對性地設(shè)計(jì)出待擴(kuò)增群落中所感興趣的綱、科或目內(nèi)的微生物的特異性引物.另外,根據(jù)編碼一些蛋白質(zhì)氨基酸殘基的D NA序列具有高度保守特異性,也可以設(shè)計(jì)PCR的引物,這些功能基因包括m cr A,p m o A,am o A,nos Z等.具體操作上,對于復(fù)雜的微生物群落,選擇

23、不同引物擴(kuò)增得到的目標(biāo)序列的回收率可能會有差異23,從而影響最終對群落結(jié)構(gòu)的解析.為了盡可能降低因引物效率和特異性差異帶來的影響,在引物設(shè)計(jì)時應(yīng)使用相應(yīng)的計(jì)算機(jī)算法,譬如利用RDP數(shù)據(jù)庫中的探針校驗(yàn)(check pro be,ARB軟件包中的探針匹配(probe m atch中來進(jìn)行分析31.設(shè)計(jì)出合適的引物以后,通常用熒光物質(zhì)標(biāo)記其5c端,以保證PCR反應(yīng)和后續(xù)分析的準(zhǔn)確性32.T2R FLP分析技術(shù)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)是整個分析的關(guān)鍵步驟之一.只有對環(huán)境樣品中的各種微生物的目的D NA片段進(jìn)行無差異的高效擴(kuò)增,才能保證擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性可以真實(shí)地反映樣品中的微生物DNA多態(tài)性.PCR有很多種,

24、包括降落PCR(to uch2do wn PCR,嵌套式PCR等等,不同PCR反應(yīng)適用于不同情況.影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的因素很多,包括模板DNA的濃度、退火溫度、反應(yīng)循環(huán)次數(shù)、PCR反應(yīng)體系的組成(例如鹽離子濃度、反應(yīng)體積的大小,Taq酶的種類和濃度以及PCR反應(yīng)程序的設(shè)定等等24,32,要通過各種優(yōu)化來確定最適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切對PCR擴(kuò)增得到的D NA片段進(jìn)行純化,除去殘留的帶熒光標(biāo)記的引物,以防止它們對后續(xù)分析和檢測造成干擾.通常選用識別4個堿基識別位點(diǎn)的合適濃度的內(nèi)切酶加到一定量純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中,在該酶最適的反應(yīng)體系和溫度下進(jìn)行限制性酶切反應(yīng).合適

25、酶量、反應(yīng)時間的確定都是要保證酶切反應(yīng)完全,以避免因酶切不完全干擾對群落結(jié)構(gòu)的分析.另外,不同核酸限制性內(nèi)切酶種類對T2RFLP圖譜會產(chǎn)生顯著的影響.研究表明,分析細(xì)菌16S r DN A多態(tài)性時,H ha I, R s a I以及B st U I這3種限制性內(nèi)切酶最為有效,可產(chǎn)生數(shù)量最多的末端限制性片段37.引物不同,同一種酶切后T2R Fs變化較大;引物一定,選擇不同的內(nèi)切酶,產(chǎn)生的T2R Fs數(shù)目也有顯著的差別.例如采用引物為8F和926R,H ha I和M s p I酶切后產(chǎn)生數(shù)量最多的末端限制性片段;換成引物341F和926R時, Alu I和Dd e I產(chǎn)生數(shù)量最多的末端限制性片段

26、41;選用引物49F和1510R,Hpy188III和H ha I可以區(qū)分的OTU最多,分別達(dá)到571和563個35.值得指出是,不同限制性內(nèi)切酶可以引入程度不同的/假帶0(pseudo2T2RF s.所以,不應(yīng)該簡單地認(rèn)為能夠產(chǎn)生數(shù)量最多的末端限制性片段的酶就是最優(yōu)的36.因此在T2RFLP分析時也應(yīng)注意限制性內(nèi)切酶的優(yōu)化選擇. 2.4電泳分離與檢測酶切后的反應(yīng)混合物要通過熱變性使內(nèi)切酶失活,所得到的酶切后的D NA片段與具熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)D NA參照物混合后,利用DNA測序儀進(jìn)行電泳分離,并且進(jìn)行熒光和熒光強(qiáng)度的檢測.末端限制性片段所帶有的熒光標(biāo)記將被測序儀檢測出,其他不帶熒光標(biāo)記的DNA片

27、段則不被檢測而不出現(xiàn)在T2 R FLP圖譜中,這個過程在有些場合被稱為/基因掃描(gene scan0.根據(jù)各個T2RF的電泳時間與標(biāo)準(zhǔn)DNA參照物進(jìn)行比較來計(jì)算T2RF的片段大小.隨著分析手段的進(jìn)步,目前D NA 自動測序儀采用的毛細(xì)管電泳比傳統(tǒng)的平板電泳具有更高的D NA片段分辨能力,對大小為60640bp的限制性片段的檢測靈敏度可達(dá)1.25bp35,DNA測序儀的自動檢測和分析保證了T2RFLP技術(shù)分析復(fù)雜微生物群落具有分辨率高、易于實(shí)現(xiàn)自動化的優(yōu)勢.通過D NA自動測序儀對DN A片段的基因掃描,利用計(jì)算機(jī)軟件分析得到T2RFLP圖譜(圖2.2.5T2RFLP圖譜的解析通過電泳分離、熒

28、光檢測和數(shù)據(jù)處理得到的T2RFLP圖譜上包含有很多微生物群落的信息.圖譜分析時,首先要確定DNA片段長度處于一個合適范圍(如94827bp,60640bp33,39,或201632bp40,并且熒光強(qiáng)度超過一定閾值(如50RFU19或100RFU32的/峰0才被作為一個有效峰納入后續(xù)的數(shù)據(jù)處理.不同的熒光檢測閾值會導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析結(jié)果的差異;提高檢測閾值,可使平行樣品T2R FLP圖譜中的不可重復(fù)峰大為減少,但同時也會使一些可重復(fù)峰消失,造成對群落多樣性的低估16.為了盡可能使結(jié)果準(zhǔn)確,Dunbar等16建議盡可能降低檢測閾值,通過平行實(shí)驗(yàn),將那些在平行實(shí)驗(yàn)的圖譜中重復(fù)再現(xiàn)的峰納

29、入統(tǒng)計(jì)分析.8636期余素林等:環(huán)境微生物群落分析的T2RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施圖2某石油污染土壤樣品中細(xì)菌群落的T2RFLP圖譜F i g.2T2RFLP profile of an archaeal co m m un it y fro m oil-con ta m i nated soil s a m p l e帶有熒光標(biāo)記物質(zhì)的T2R F被D NA測序儀中的熒光檢測器檢測出來,反映為T2RFLP圖譜中的各個/峰0.峰對應(yīng)的橫坐標(biāo)代表了T2RF的片段長度,是根據(jù)該T2RF與標(biāo)準(zhǔn)樣品中長度已知的D NA片段在電泳中的位置進(jìn)行比較后計(jì)算得到的;峰對應(yīng)的縱坐標(biāo)代表含有熒光物質(zhì)T2RF的熒光強(qiáng)度

30、;峰面積代表了具有相同片段長度所有T2RF的熒光強(qiáng)度的總和.每一個峰可以作為一個OT U來進(jìn)行分析,那么T2RFLP圖譜中就可以包含以下信息:¹物種豐度(r i chness:S=圖譜中顯著峰的總數(shù).這里粗略認(rèn)為每個峰對應(yīng)著一個不同的物種.º多樣性指數(shù):描述群落多樣性的指數(shù)有很多,如通過以上T2RFLP圖譜,可以計(jì)算Shanno n-W e i ner指數(shù):H=-r piln pi 或S i m pson指數(shù):D=1-r p2i其中,pi表示某個峰的峰高占總峰高的比例.»物種均度(evenness:E=H Hm ax其中,Hm ax=ln S對于實(shí)驗(yàn)得到的多個群落

31、的T2RFLP圖譜,可以分別計(jì)算上面的這些指標(biāo),進(jìn)行群落間的比較分析,也可以構(gòu)造每個群落在一定意義下的距離矩陣,通過計(jì)算群落相似度對不同群落圖譜進(jìn)行定量比較39.環(huán)境微生物群落通常都非常復(fù)雜,具有很高的多樣性,表現(xiàn)在T2RFLP圖譜上就是具有數(shù)量相當(dāng)多的顯著峰,一般用人工或簡單直觀的方法來進(jìn)行數(shù)據(jù)解析比較群落極為困難.因此,T2RFLP圖譜的準(zhǔn)確分析要利用一些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法或生物數(shù)學(xué)中的許多專門算法,這些算法包括:冗余分析(redundancy a2 nalysis、聚類分析(cluste r Ana l ysis42、自組織神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析法(self2organizi ng m ap neura

32、l net works,S O M s、主成分分析法(pri nc i pal co m ponent ana l ysis,PCA43等等,而具體的運(yùn)算可以用一些專門的商業(yè)軟件來完成.事實(shí)上,當(dāng)前利用T2RFLP 技術(shù)進(jìn)行復(fù)雜群落研究的一個最新領(lǐng)域就集中在圖譜的分析和數(shù)據(jù)處理42,目的是使T2RFLP技術(shù)成為微生物群落研究的最強(qiáng)有力的工具之一.在T2RFLP圖譜分析中一個很重要的方面是了解每個峰是否代表一種微生物,或者具體代表哪些微生物,只有具體了解每個峰所對應(yīng)的微生物種類才能給出準(zhǔn)確和真實(shí)的微生物群落結(jié)構(gòu)圖譜.盡管在很多情況下,可以粗略認(rèn)為每個峰對應(yīng)著一個微生物物種,但是研究表明,不同DN

33、 A片段進(jìn)行限制性酶切有可能得到相同的T2RF,所以為了了解每個T2RF所代表的物種,還需要對T2R F對應(yīng)的D NA片段的序列進(jìn)行分析.通常做法是對群落D NA進(jìn)行克隆、篩選、測序以及分析進(jìn)化史來了解每個T2RF所代表的物種.3T2RFLP在微生物群落研究中的應(yīng)用簡介近7a來,國外研究者利用T2RFLP技術(shù)開展了大量的微生物群落結(jié)構(gòu)方面的研究,表1列舉了一些代表性的研究.4T2RFLP分析微生物群落的局限性及其解決方法T2RFLP與其它任何方法一樣也有自己的局限性:1T2 R FLP是基于PCR擴(kuò)增的技術(shù),因此就擺脫不了這類技術(shù)共同的缺陷,例如群落中不同菌種DN A的差異性擴(kuò)增,以及目標(biāo)D

34、NA在菌種間拷貝數(shù)的差異等等58,59,造成分析結(jié)果難以準(zhǔn)確反映自然群落的多樣性以及物種間的相對豐度信息;2該指紋印記技術(shù)只檢測帶熒光標(biāo)記的末端限制性片段,從理論上講,T2RFLP圖譜中每個T2RF有可能不只對應(yīng)一個菌種,造成對群落多樣性的低估;3酶切后T2RF的長度分布也會造成對復(fù)雜群落多樣性的低估;因?yàn)闇y序儀檢測500bp以上的T2 R F精度不夠.對于更長的片段,檢測分辨率明顯下降60;4實(shí)驗(yàn)過程影響因素眾多,使得T2RFLP圖譜的解析存在一定的不確定性;比如DNA提取方法、PCR中的參數(shù)設(shè)置及限制性內(nèi)切酶等的選擇都可能直接對最終的T2RFLP圖譜產(chǎn)生影響;5如何對大量T2RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)

35、行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以挖掘出其中蘊(yùn)含的微生物群落結(jié)構(gòu)信息是目前T2RFLP技術(shù)研究的焦點(diǎn)之一,很多理論和技術(shù)上的問題仍處于摸索和逐步完善階段,例如,目前對某個群落的T2R FLP圖譜構(gòu)造的距離矩陣來進(jìn)行復(fù)雜群落的比較分析時,通常仍以某個峰的出現(xiàn)與否分別定義為1或0,從而將每張T2RFLP圖轉(zhuǎn)化為一張二進(jìn)制數(shù)表39,這種方法沒有將相應(yīng)的峰高數(shù)據(jù)考慮進(jìn)去.864應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報Ch i n J App lE n vi ron B i o l12卷表1T2RFLP分析技術(shù)在微生物群落研究中的應(yīng)用Tab le1Applica ti on of T2RFLP ana l ysis in m i cro

36、bial co mmunity study序號Numb er 研究內(nèi)容A i m主要結(jié)論M ain concl u sion文獻(xiàn)來源Ref eren ceT2RFLP技術(shù)用于研究微生物群落的多樣性App li cati on of T2RFLP approach f or analyzi ng b i od ivers i ty ofm icrob ial co mm unity1分析市政污水廠好氧生物處理池污泥等4種樣品中的微生物群落多樣性To i nvestigate t h e b i odivers it y ofm icro2b ial co mm un ity i n aerob

37、ic acti vated s l udge fro m m un i ci palwaste water treat m en t p lantT2RFLP技術(shù)是分析微生物群落多樣性的可靠有力的工具T2RFLP app roach is powerf u l and reliab l e for an al yzi ngb i od i vers it y ofm icrob i al co m m un i ty412研究了處理生活污水的強(qiáng)化生物除磷工藝(EBPR工藝中活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)Study on activatedsl udge m icrob i al co mmun it

38、y i n enhanced b i ological phos2phorus re m oval(EBPRp rocess兩種運(yùn)行方式下活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯差異,而用FIS H技術(shù)卻未發(fā)現(xiàn)差異Detected by T2RFLP,s tructure ofm icrob ial co m m un it y i s re m arkab l y dif2ferent i n t w o d ifferen t runn i ng processes,wh il e F I S H cannotreveal t h e difference443分析美國西南部4種不同性質(zhì)的土壤中的

39、微生物群落To anal yze m i crob ial co m m un i ty fro m4d i ff eren t soils i ns outhwestern Am ericaT2RFLP技術(shù)能簡便快速地分析土壤微生物群落多樣性T2RFLP techn i que can reveal b i od i versity of soil m i crob i alco m m un it y easil y394研究一個實(shí)驗(yàn)規(guī)模的生物反應(yīng)器的活性污泥中真核微生物群落St udy on eukaryoti c acti vated sl udge m i crob i alco m

40、mun it y in a lab-scal e b i oreact orT2RFLP要比DGGE分辨率更高,非常適合用于對微生物群落多樣性進(jìn)行快速、靈敏的分析評價T2RFLP has ah i gher sensiti vity t h an DGGE,wh ich m akes T2RFLP mores u itab l e f or m icrob i al co m m un it y anal yses46T2RFLP技術(shù)用于研究微生物群落受各種環(huán)境因子影響后的時空變化規(guī)律App lication of T2RFLP approach f or an al yzi ng spati

41、 al te m poral pat2 ter n ofm icrob ial com m un i ty i n fl uenced by any environm en t al factor1在3種性質(zhì)差異顯著的土壤中都加入兩種不同的有機(jī)肥,用T2RFLP技術(shù)考察土壤中真菌群落的動態(tài)變化An al yses of fungal com m unity in d iff eren t soils fertiliz ed witht wo k i nd s ofm anu res每種土壤中加入有機(jī)肥后,真菌群落都會發(fā)生變化;而且某種土壤加入不同的有機(jī)肥,其中的真菌群落的變化呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)F

42、ungal co mmun it y changes i n d ifferen ts o il s and differen tm anure add i ti on s332研究種植不同品種馬鈴薯的農(nóng)田土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到的影響及其變化To study m i crob i al co mmun it y i ns o il s plan t ed w it h d ifferen t k i nd s of potat oesT2RFLP技術(shù)用于分析高度多樣的土壤細(xì)菌群落時,不僅可以揭示群落結(jié)構(gòu)的空間異質(zhì)性,而且能夠揭示群落結(jié)構(gòu)隨時間的變化規(guī)律T2RFLP approach can r

43、eveal t hes pati al and te m poral change of m icrob i al co m m un i ty stru c2t u re153研究在實(shí)驗(yàn)室控制的微宇宙環(huán)境下對土壤受銅離子污染后微生物群落發(fā)生的動態(tài)變化T o st udy the i n fluenceof cupper i on on soil m icrob i al com m un i ty i n a m i crocos mst udy未受銅污染的背景土壤、輕度污染、重度污染土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著的差異Si gn ifi can t d ifference ofm i cro

44、b ial co m m un it y s truct ure was detected by T2RFLP a2m ong s o il s wit h d ifferent i on conta m i nati ons484分析因施用除草劑4,6-二硝基甲酚對農(nóng)田土壤中微生物群落的影響Infl uence of DNOC on agricu l tural s o ilm i2crobial com m un i ty每公斤土壤樣品中加入50m g DNOC,15d以后,微生物種類大為減少,T2RFLP圖譜中僅能檢測到23個顯著峰M i crob i al s peci es redu

45、ced m ark edly after DNOC add iti on49T2RFLP用于研究環(huán)境微生物群落中的特殊功能基因App licati on of T2RFLP approach for ana l yzi ng special gen es i n environm ental m icrob i al co mmun it y1以甲烷氧化菌的pm o A基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,研究稻田土壤中甲烷氧化菌群落的多樣性T o st udy b i odivers it y ofm et h anotroph co mmun ity i n paddy s o il by anal yzi

46、ng p m oAgene對于DGGE,T2RFLP分析群落結(jié)構(gòu)具有更高的分辨率T2RFLP has a h i gher sensiti vity than DGGE382擴(kuò)增群落中的編碼氨單加氧酶的a m o A基因序列,研究氨氧化菌群的多樣性To study b i od i vers it y of a mm on i a ox2i d izi ng m icrob ial com m un i ty by an al yzi ng a moA gen eT2RFLP技術(shù)是一種可靠的手段,可用于快速分析環(huán)境樣品中氨氧化菌群的群落結(jié)構(gòu)T2RFLP is a reliab l e ap2p

47、 roach t o anal yze struct u re of a m m on ia oxi d izi ng m i crob i alco m m un it y543通過擴(kuò)增編碼反硝化過程中一關(guān)鍵酶的n i rS基因來研究太平洋海底沉積物中反硝化菌群的組成To st udy de2n itrif y i ng bacteri al co mm un ity i n pacific s ed i m en ts by anal y2zi ng n irS gen e擴(kuò)增得到的n i rS基因序列用H haI、M s p I以及T aqI酶切后分別產(chǎn)生多達(dá)173、139和131個T2

48、RFs,說明T2RFLP分析反硝化菌群落的分辨率很高T2RFLP is a s en siti veapproach f or anal yzi ng den itrif yi ng bacteri al co m m un it y,173,139and131n i rS gene T2RFs were det ect ed wh enH haI、M spI and TaqI were app li ed res pecti vel y374根據(jù)汞抗性基因m er基因序列設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物,檢測和評價該基因在長期受汞污染的土壤和沉積物中的存在情況To d etect and eval uate

49、 m er gene i n s o il s and sed i2m en ts poll u ted with m ercu ry方便高效,還從土壤和沉積物T2RFLP圖譜中發(fā)現(xiàn)了新的汞抗性基因型New m er gene type was detected by T2RFLP m et hod56為了解決上述局限性,需要根據(jù)研究目的、樣品、環(huán)境條件等對T2RFLP分析的各個步驟進(jìn)行優(yōu)化,克服不足,盡可能地使分析結(jié)果準(zhǔn)確、真實(shí).這些方法包括:對DNA片段進(jìn)行克隆、測序和分析,了解各個T2RF所代表的所有微生物種類;利用多種酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行酶切,將多個T2RFLP圖譜進(jìn)行綜合分析2

50、0,以減少因一個T2RF可能對應(yīng)多個物種造成對8656期余素林等:環(huán)境微生物群落分析的T2RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施866 應(yīng) 用與 環(huán) 境生 物學(xué) 報 C h in J App l E n viron B io l 12卷 群落多樣性低 估的 問題; 利 用毛 細(xì)管 電泳 技術(shù), 提 高對 1 000 bp以下 片段的分辨率 60 等等. 總之, 盡管 T2RFLP 技術(shù)存在不 少的缺陷, 但 是, 在 復(fù)雜微 生物群落的研究中, 該技術(shù)仍然具有其它許多分子生物學(xué)技術(shù) 所 不 具 備 的 優(yōu) 越 性. 大 量 的 研 究 表 明, 與 DGGE / TGGE 2, 15, 38, 40, 46

51、 或 RFLP /ARDRA 61相比, T2R FLP 技術(shù)分析 復(fù)雜的微生物群落結(jié) 構(gòu)具有更高的分辨率, 更適合于對微生物 群落多樣性進(jìn)行靈敏的 分析評 價, 以及快 速地研究、 析微生 分 物群落的變化規(guī)律. of 5c- nuclease PCR for qu ant itat ive detect ion of listeria m onocytogenes in pure cu ltures water sk i m ilk and unpas teu rized who lem ilk. App l , , m , & Environ M icrobiol, 2000 6

52、6 ( 10 : 4266 4271 , 5 Voytek MA, W ard BB D etect ion of ammoniu . m2ox id izing bacteria of the beta2sub class of th e class P roteobacteria in aquat ic samp les w ith the PCR. App l& Environ M icrobiol, 1995 61 ( 4 : 1444 1450 , 6 Dunbar J Tak ala S Barns S. M, Davis JA Ku ske CR. Levels of b

53、ac2 , , , terial co mmun ity d ivers ity in f r arid soils co ou mpared by cu ltivation and 16S r RNA gene clon ing App l & Environ M icrobiol, 1999, 65 ( 4 : . 1662 1669 7 R ondon MR, August PR, B etter ann AD, B rady SF, G rossm an TH, m L iles MR, Loiacono KA Lynch BA M acn eil I M inor C, T

54、iong CL , , A, , G il an M, OsburneM S C lardy J H andelsm an J Good an RM. C lo m , , , m 2 n ing the soil m etageno e a s trategy f accessing th e genet ic and func2 m: or t ion al divers ity of uncu ltu red m icroorgan is s A m . ppl& Environ M icrobiol , 2000, 66 ( 6: 2541 2547 8 L lobet- B

55、rossa E, R ossell - Mora R, Amann R. M icrob ial co mmun ity composit ion ofW adden Sea sed i en ts as revealed by flu orescen ce in situ m hyb rid ization Appl & E nviron M icrobiol, 1998, 64 ( 7: 2691 2696 . 9 M acdonald R, BrÊ VS C o un ity analysis of b acterial b iofil s in a zel . mm

56、m s i u lated recircu lating coo ling2 m water system by fluorescence in situ hy 2 brid izat ion with r RNA2targeted o ligonucleot ide p robes . 2000, 34 ( 9: 2439 2446 10 W u L, Con rad R. Fun ct ional and stru ctural response of a cellu losedegrad ing m ethanogen icm icrob ia l co un ity to mu lt

57、iple aeration stres mm 2 ses at two d iff eren t temperatu res Environ M icrobiol, 2001, 3 ( 6 : . 355 362 11 W u XL Ch in KJ Stubner S Conrad R. Functional pat terns and tem2 , , , peratu re response of cellu lose2f m ent ing m icrob ial cu ltu res con taining er d ifferent m eth anogen ic co mmun

58、ities App l M icrobiol & B iotechnol . , 2001 56 ( 1 2: 212 219 , 12 Acin as SG R odr , guez- V alera F, Ped r s- A li Spat ial and tem po C. 2 ral variat ion in m arine bacteriop lank ton d iversity as sho by RFLP fin2 wn gerp rint ing of PCR am p lified 16S r DNA. FEM SM icrobiol E col 1997 , , 24 ( 1: 27 40 13 R Ê e S, Gurtn er C, D rewello U, Drewel lo R, Lub itz W, W eiss llek 2 m ann R. Analysis of bacterial co un ities on h