第四章_超薄切片技術(shù)ppt課件

1、生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)第四章 超薄切片技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)一、生物樣品制備技術(shù)的重要性一、生物樣品制備技術(shù)的重要性二、二、TEMTEM樣品制備技術(shù)分類(lèi)樣品制備技術(shù)分類(lèi)四、超薄切片技術(shù)概述四、超薄切片技術(shù)概述第一節(jié)第一節(jié) 基本概念基本概念三、掃描電鏡樣品制備技術(shù)三、掃描電鏡樣品制備技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)一、生物樣品制備技術(shù)的重要性一、生物樣品制備技術(shù)的重要性1電鏡本身的分辨本領(lǐng) 2樣品的結(jié)構(gòu)和反差，而樣品的結(jié)構(gòu)與反差在很 大程度又取決于樣品制備技術(shù)1、決定電鏡圖像分辨率的兩個(gè)因素、決定電鏡圖像分辨率的兩個(gè)因素2、電鏡樣品應(yīng)具備的基本條件、電鏡樣品應(yīng)具備的基

2、本條件1樣品必須徹底干燥；2樣品要進(jìn)行提高反差處理3樣品厚度要適宜4樣品耐受電子束的轟擊5充分保存好生物樣品的超微結(jié)構(gòu)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)二、二、TEMTEM樣品制備技術(shù)分類(lèi)樣品制備技術(shù)分類(lèi)1、超薄切片技術(shù)普通）2、冷凍超薄切片技術(shù)3、冷凍置換和低溫包埋技術(shù)4、金屬投影技術(shù)5、表面復(fù)型技術(shù)6、冷凍(斷裂)蝕刻及復(fù)型技術(shù)7、免疫電鏡技術(shù)8、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù) TEM，SEM共有9、電鏡放射自顯影技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)1、表面鍍金噴鍍技術(shù)2、組織導(dǎo)電技術(shù)3、冷凍斷裂技術(shù)4、離子蝕刻技術(shù)5、臨界點(diǎn)干燥技術(shù)6、冷凍干燥技術(shù)7、鑄型觀察技術(shù)復(fù)型） 注： 最基本、最經(jīng)典的還是超薄切

3、片技術(shù)SEM,TEM共有三、掃描電鏡樣品制備技術(shù)三、掃描電鏡樣品制備技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)四、超薄切片技術(shù)概述四、超薄切片技術(shù)概述1、超薄切片、超薄切片樣品厚度在10100nm之間的切片為 石蠟切片h=10m(550m) 超薄切片TEM專(zhuān)用，一般5007002、制作超薄切片的必要性、制作超薄切片的必要性1). 增加電子透射能力2). 電鏡的場(chǎng)深大，切片太厚，上下結(jié)構(gòu)重 疊,使得圖像不清楚3). 減少色差4). 減少樣品對(duì)電子的吸收生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù) 細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存良好，沒(méi)有明顯的物質(zhì)凝聚、喪失、添加等人工效應(yīng) 切片厚度500700為宜 ,小于1000 太?。焊?，

4、反差低太厚：低，反差好，結(jié)構(gòu)重疊，電子甚至 不 能穿透 切片應(yīng)耐電子束的強(qiáng)烈照射，不變形，升華 切片能夠適當(dāng)被染色，保證一定的反差 切片均勻，無(wú)皺褶、刀痕，無(wú)染色劑或其他 化學(xué)物質(zhì)的沉淀3、對(duì)超薄切片的要求、對(duì)超薄切片的要求生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)取材固定脫水浸透包埋聚合修塊切片染色4、超薄切片制備的一般程序：、超薄切片制備的一般程序：生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 普通超薄切片技術(shù)普通超薄切片技術(shù)一一 取材取材二二 固定固定三三 脫水脫水四四 滲透與包埋滲透與包埋五五 超薄切片超薄切片六六 電子染色電子染色生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù) 操作規(guī)則:快,小, 冷,準(zhǔn),穩(wěn)

5、,輕(防損傷) 快：動(dòng)作迅速,快取,投入固定液 ?。簶悠敷w積小,動(dòng)1mm3,植寬1，長(zhǎng)34 冷：04 準(zhǔn)：取的部位準(zhǔn)，有代表性、目的性 輕：操作輕巧，避免拉、鋸、壓一、取材一、取材1、含義、含義指從生物體上取下要觀察的組織塊。2、取材操作規(guī)則、取材操作規(guī)則注意：由于水解酶的作用可引起細(xì)胞自溶注意：由于水解酶的作用可引起細(xì)胞自溶生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)動(dòng)物材料麻醉解剖 戊二醛預(yù)固定（ 04， 25）在預(yù)冷的玻板上細(xì)切1mm3） 戊二醛前固定(13h) 漂洗1030min） 1鋨酸后固定(12h)植物材料葉片寬1，長(zhǎng)34，有時(shí)需脫蠟根莖果實(shí)1mm3單細(xì)胞：洗去有機(jī)成分固定預(yù)包埋切塊3、取材

6、方法、取材方法A、按樣品類(lèi)別分為：、按樣品類(lèi)別分為：B、按取材地點(diǎn)分為：、按取材地點(diǎn)分為： 野外取材：冰壺實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)取材生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)1、概念：用化學(xué)或物理方法迅速將細(xì)胞、組織、概念：用化學(xué)或物理方法迅速將細(xì)胞、組織殺死殺死,同時(shí)把從細(xì)胞間的聯(lián)系到細(xì)胞器的分子結(jié)同時(shí)把從細(xì)胞間的聯(lián)系到細(xì)胞器的分子結(jié)構(gòu)等全部組織的活體形態(tài)、精細(xì)結(jié)構(gòu)及其組成構(gòu)等全部組織的活體形態(tài)、精細(xì)結(jié)構(gòu)及其組成真實(shí)的保存下來(lái)真實(shí)的保存下來(lái).2、常用的固定方法、常用的固定方法化學(xué)方法：鋨酸化學(xué)方法：鋨酸OsO4), 戊二醛戊二醛 （C5H8O2), 甲醛甲醛(HCHO)，高錳酸鉀，高錳酸鉀KMnO4、 重鉻酸鉀、

7、丙烯醛重鉻酸鉀、丙烯醛物理方法：冷凍，枯燥，高溫物理方法：冷凍，枯燥，高溫二、固定二、固定（一固定的基本知識(shí)（一固定的基本知識(shí)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù) 把細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)定格，要求生命過(guò)把細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)定格，要求生命過(guò) 程立即停止程立即停止,細(xì)胞和它周?chē)M織中的半液細(xì)胞和它周?chē)M織中的半液 體內(nèi)含物立即凝固而不分解體內(nèi)含物立即凝固而不分解,接近細(xì)胞有接近細(xì)胞有 機(jī)體的生活狀態(tài)機(jī)體的生活狀態(tài) 防止以后的制備過(guò)程中丟失或添加成分防止以后的制備過(guò)程中丟失或添加成分 使其在電鏡下有良好的電子反差使其在電鏡下有良好的電子反差3、固定的目的、固定的目的生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)4、固定的標(biāo)

8、準(zhǔn)、固定的標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)線(xiàn)條清晰連續(xù)不斷，細(xì)細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)線(xiàn)條清晰連續(xù)不斷，細(xì)胞基質(zhì)無(wú)明顯溶泡和顆粒凝集胞基質(zhì)無(wú)明顯溶泡和顆粒凝集生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)1組成： 固定液：固定劑緩沖液2作用： 破壞細(xì)胞的酶活性系統(tǒng) 穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分，并保存之 接近細(xì)胞生活狀態(tài)的滲透壓,使細(xì)胞不收縮或膨脹 在組分的分子之間建立交聯(lián)，提供骨架穩(wěn)定細(xì)胞器的空間構(gòu)型 提供一定的電子反差5、固定液的作用、固定液的作用生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)1滲透力強(qiáng)，穿透速度快，能迅速達(dá)到組織塊的各部位，立即殺死細(xì)胞，以盡量減小死后變化2穩(wěn)定細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，使各種結(jié)構(gòu)成分凝固或變性，以保證后續(xù)的各種處理中物質(zhì)不溶 解

9、、不丟失3使細(xì)胞不變形，保持各種結(jié)構(gòu)生活時(shí)形狀，不產(chǎn)生人工假象，以保證電鏡圖像的真實(shí)性。4) 能保存一定的酶活性,以供細(xì)胞化學(xué)的測(cè)定5) 最好提供一定的反差 ,并有防腐作用（二常用的固定劑（二常用的固定劑1、常用、理想固定劑應(yīng)具備的條件生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 幾乎和細(xì)胞內(nèi)所有成分發(fā)生化學(xué)結(jié)合幾乎和細(xì)胞內(nèi)所有成分發(fā)生化學(xué)結(jié)合 對(duì)氮具有較強(qiáng)親和力，對(duì)含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定作對(duì)氮具有較強(qiáng)親和力，對(duì)含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定作 用良好用良好 可保存脂肪可保存脂肪,形成脂肪形成脂肪-鋨復(fù)合物鋨復(fù)合物 Z=76，增加膜的反差，增加膜的反差 對(duì)磷脂蛋白、核蛋白保護(hù)很好對(duì)磷脂蛋白、核蛋白

10、保護(hù)很好2 2、理想固定劑、理想固定劑1 1鋨酸鋨酸OsO4)OsO4)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)鋨酸缺點(diǎn)： 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，對(duì)微管固定效果差 酶的鈍化劑，不能用于細(xì)胞化學(xué)研究 分子量大,滲透能力差，要求組織塊小 固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng) 可與乙醇、醛類(lèi)氧化還原反應(yīng)生成沉積 有揮發(fā)性、劇毒生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)2戊二醛（ C5H8O2）優(yōu)點(diǎn)： 固定迅速，樣品塊可以大于固定迅速，樣品塊可以大于1mm3 能保存糖元、蛋白質(zhì)、核蛋白，核酸，尤其對(duì)微能保存糖元、蛋白質(zhì)、核蛋白，核酸，尤其對(duì)微 管，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等固定效果最好，對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有較管，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等固定效果最好，對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有較

11、強(qiáng)的親和力強(qiáng)的親和力 可長(zhǎng)時(shí)間固定（可長(zhǎng)時(shí)間固定（7天），適于野外取材天），適于野外取材 不易使酶失活，適于細(xì)胞化學(xué)研究不易使酶失活，適于細(xì)胞化學(xué)研究 不揮發(fā)，但容易經(jīng)皮膚吸收，對(duì)呼吸道粘膜有不揮發(fā)，但容易經(jīng)皮膚吸收，對(duì)呼吸道粘膜有 刺激性刺激性生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù) 戊二醛缺點(diǎn)： 不保存脂肪 無(wú)電子染色作用 對(duì)緩沖液的要求嚴(yán)格很差很好糖元良好很好好鋨酸很差很好尚好戊二醛脂類(lèi)核蛋白蛋白質(zhì)固定劑不強(qiáng)有小很差強(qiáng)無(wú)大較好對(duì) BS的選擇性電子染色浸透核酸四氧化鋨與戊二醛的固定作用比較四氧化鋨與戊二醛的固定作用比較鋨酸戊二醛固定劑生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)雙固定法：指用戊二醛對(duì)樣品前固定

12、，漂洗雙固定法：指用戊二醛對(duì)樣品前固定，漂洗后使用鋨酸對(duì)樣品進(jìn)行后固定，這種使用兩后使用鋨酸對(duì)樣品進(jìn)行后固定，這種使用兩種化學(xué)試劑分別前后對(duì)樣品進(jìn)行固定的方法種化學(xué)試劑分別前后對(duì)樣品進(jìn)行固定的方法稱(chēng)為雙固定法。稱(chēng)為雙固定法。3) 3) 甲醛甲醛HCHOHCHO） ：甲醛戊二醛：甲醛戊二醛 滲透速度快、固定迅速，對(duì)酶活滲透速度快、固定迅速，對(duì)酶活 性的保性的保護(hù)優(yōu)于護(hù)優(yōu)于 戊二醛，經(jīng)濟(jì)方便戊二醛，經(jīng)濟(jì)方便4) 4) 高錳酸鉀高錳酸鉀KMnO4)KMnO4) 磷脂蛋白，對(duì)神經(jīng)髓脂質(zhì)很好，細(xì)胞膜磷脂蛋白，對(duì)神經(jīng)髓脂質(zhì)很好，細(xì)胞膜性結(jié)性結(jié) 構(gòu)、葉綠素固定良好。構(gòu)、葉綠素固定良好。生物電子顯微技術(shù)生物電

13、子顯微技術(shù)1、緩沖液：一種仿效細(xì)胞外液成分，對(duì)細(xì)胞富有生理保護(hù)功能的溶液2、緩沖液主要作用 維持穩(wěn)定的pH值 提供適當(dāng)?shù)臐B透壓 提供適當(dāng)?shù)碾x子成分使樣品不抽提，不沉淀3、附加劑：調(diào)節(jié)滲透壓，NaCL, CaCL2，蔗糖，葡萄糖（三緩沖液和附加劑（三緩沖液和附加劑生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)儲(chǔ)備A液(0.2M):磷酸氫二鈉 (Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml儲(chǔ)備B液(0.2M):磷酸二氫鈉 (NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml 0.1M磷酸緩沖液PBS），由儲(chǔ)備A液(0.2M)和儲(chǔ)備B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀釋定容到100ml。 優(yōu)

14、點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，廉價(jià)，易于大量配置 缺點(diǎn)：易產(chǎn)生沉淀，不穩(wěn)定，易受到細(xì)菌污染pH25。C）6.26.66.87.07.27.47.6A液9.2518.7524.530.536.040.543.5B液40.7531.2525.519.514.09.56.5磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液4、常用緩沖液、常用緩沖液生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)巴比妥鹽巴比妥鹽 對(duì)鋨酸適用，戊二醛不能，對(duì)鋨酸適用，戊二醛不能，不長(zhǎng)期保存不長(zhǎng)期保存二鉀胂酸鹽二鉀胂酸鹽 可長(zhǎng)期保存，有毒，有臭可長(zhǎng)期保存，有毒，有臭味味（四）、固定（四）、固定1、固定液的配制生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)單固定： 戊二醛或鋨酸單次固定13

15、小時(shí)雙固定： 前固定戊），漂洗，后固定鋨）多重固定： 用三種以上的固定劑對(duì)樣品進(jìn)行固定 2、固定的方法、固定的方法1按固定液的成分劃分為：按固定液的成分劃分為：2按固定方式分為：按固定方式分為： a. 浸泡固定浸泡固定 b. 體外固定體外固定 c. 原位固定原位固定 d. 灌流固定灌流固定生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)固定操作示意圖生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)漂洗操作方法生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)1) 固定液的濃度:戊二醛1-5%,鋨酸1-3% 濃度低固定時(shí)間長(zhǎng)細(xì)胞質(zhì)的抽提,組織腫脹 濃度高易損細(xì)胞微結(jié)構(gòu),OsO4或KMnO4可使蛋 白質(zhì)分子氧化而斷裂2) 固定液的滲透壓： 滲透壓

16、低細(xì)胞器或整個(gè)細(xì)胞膨脹 滲透壓高細(xì)胞收縮3) pH值：植物6.87.1,動(dòng)7.27.44) 固定的溫度：04 但低溫對(duì)細(xì)胞微絲、微管有害5) 組織塊的大小：0.51mm36) 固定液的用量，一般為組織塊的500倍3、固定注意事項(xiàng)：生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)三三 脫水脫水(dehydrate)(dehydrate)1. 定義：定義： 用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑取代組織和細(xì)胞中的用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑取代組織和細(xì)胞中的 游離態(tài)水分的過(guò)程。游離態(tài)水分的過(guò)程。2. 脫水的原因：脫水的原因： 包埋時(shí)一般使用非水溶性包埋劑，為了更好的包埋時(shí)一般使用非水溶性包埋劑，為了更好的包埋樣包埋樣 品，提高包埋質(zhì)量必須對(duì)樣品脫

17、水；品，提高包埋質(zhì)量必須對(duì)樣品脫水； 濕樣品反差低、必須干濕樣品反差低、必須干 燥；燥； 含水樣品在高真空下容易被破壞。含水樣品在高真空下容易被破壞。3. 脫水的原則：逐級(jí)梯度脫水脫水的原則：逐級(jí)梯度脫水(80%及以前及以前4) 305070809095(每次每次5 15min)100(23次，每次次，每次15min)100環(huán)環(huán) 氧丙烷氧丙烷(乙醇脫水時(shí)必須的一步驟乙醇脫水時(shí)必須的一步驟,15min) 生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)4. 常用的脫水劑：常用的脫水劑： 乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、 環(huán)氧丙烷、包埋劑的單體。環(huán)氧丙烷、包埋劑的單體。5.

18、 脫水注意事項(xiàng)脫水注意事項(xiàng): 脫水要徹底脫水要徹底 更換液體動(dòng)作要迅速更換液體動(dòng)作要迅速 脫水時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)脫水時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng) 固定后的固定后的 樣品要充分漂洗樣品要充分漂洗生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)附加步驟：塊染附加步驟：塊染Block Staining)塊染：在脫水前或脫水時(shí)對(duì)組織塊進(jìn)行的染色塊染：在脫水前或脫水時(shí)對(duì)組織塊進(jìn)行的染色叫塊染。（在切成片之后的染色可稱(chēng)為叫塊染。（在切成片之后的染色可稱(chēng)為“片片染染”）脫水前染色：脫水前染色：雙固定雙固定 漂洗漂洗 0.54%的醋酸雙氧鈾的醋酸雙氧鈾染色，染色，1h,4脫水脫水脫水時(shí)染色：脫水時(shí)染色：脫水至脫水至70乙醇乙醇 硝酸鉛的硝酸鉛的7

19、0乙醇飽和溶乙醇飽和溶液中液中2h,4 70乙醇漂洗乙醇漂洗 繼續(xù)脫水繼續(xù)脫水生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)四四 滲透與包埋滲透與包埋 目的：使包埋劑逐步滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部目的：使包埋劑逐步滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部, ,以便與以便與 細(xì)胞外的包埋劑同時(shí)聚合，以保證切出優(yōu)質(zhì)細(xì)胞外的包埋劑同時(shí)聚合，以保證切出優(yōu)質(zhì) 的超薄切片。的超薄切片。 步驟：浸透，包埋，聚合步驟：浸透，包埋，聚合（一）、浸透（一）、浸透Infiltrate)Infiltrate) 浸透：用另一種溶液或混合液逐漸取代組織內(nèi)的脫浸透：用另一種溶液或混合液逐漸取代組織內(nèi)的脫 水劑或前介質(zhì)），使細(xì)胞內(nèi)外所有的空隙水劑或前介質(zhì)），使細(xì)胞內(nèi)外

20、所有的空隙 被滲透液填充。被滲透液填充。 脫水劑的比例脫水劑的比例包埋劑包埋劑純包埋劑純包埋劑 脫水劑脫水劑: :包埋劑包埋劑3:1 1:1 1:3 3:1 1:1 1:3 純包埋劑純包埋劑生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù) 滲透時(shí)間表(小時(shí)）脫水劑：包埋劑動(dòng)物材料植物材料體外培養(yǎng)細(xì)胞3：1110.51：1141120.511：3122120.5包埋：將滲透好的樣品塊放入到適當(dāng)?shù)陌癜瘢簩B透好的樣品塊放入到適當(dāng)?shù)陌衲＞咧?，灌裝上純包埋劑包埋，經(jīng)加溫聚合模具中，灌裝上純包埋劑包埋，經(jīng)加溫聚合形成一種固體基質(zhì)，牢固地支撐整個(gè)細(xì)胞結(jié)形成一種固體基質(zhì)，牢固地支撐整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織，同時(shí)又不混亂其空

21、間聯(lián)系，制成構(gòu)或組織，同時(shí)又不混亂其空間聯(lián)系，制成適于機(jī)械切割的固體包埋塊。適于機(jī)械切割的固體包埋塊。（二）、包埋（二）、包埋(embedding)(embedding)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)1 1、包埋劑應(yīng)具備的條件、包埋劑應(yīng)具備的條件: : 聚合有良好的切割性能，軟硬度易調(diào)節(jié)聚合有良好的切割性能，軟硬度易調(diào)節(jié) 粘度低粘度低,易滲透易滲透 溶于脫水劑溶于脫水劑 電子透明度好電子透明度好,并具有一定的反差并具有一定的反差 聚合要充分、均勻，聚合溫度要盡可能低聚合要充分、均勻，聚合溫度要盡可能低 本身無(wú)結(jié)構(gòu)本身無(wú)結(jié)構(gòu) 熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性好,可耐電子束轟擊可耐電子束轟擊 來(lái)源豐富，且各批

22、號(hào)性能盡可能一致來(lái)源豐富，且各批號(hào)性能盡可能一致 切片易染色切片易染色,且對(duì)人體無(wú)害且對(duì)人體無(wú)害生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)2 2、常用包埋劑、常用包埋劑1) 甲基丙烯酸酯甲基丙烯酸酯 優(yōu)點(diǎn)：分子量小，粘度低優(yōu)點(diǎn)：分子量小，粘度低,易滲透；易滲透；,硬度易硬度易調(diào)節(jié)，切割性能好；電子透明度高，電子反差調(diào)節(jié)，切割性能好；電子透明度高，電子反差好；無(wú)毒性，廉價(jià)好；無(wú)毒性，廉價(jià) 缺點(diǎn)：聚合需要一定條件；聚合后體積變?nèi)秉c(diǎn)：聚合需要一定條件；聚合后體積變化大，聚合損傷大；不穩(wěn)定，不耐電子束轟擊化大，聚合損傷大；不穩(wěn)定，不耐電子束轟擊易升華或蒸發(fā)易升華或蒸發(fā)2) 聚酯樹(shù)脂聚酯樹(shù)脂 優(yōu)點(diǎn)：對(duì)樣品損傷小，

23、耐電子束的轟擊，聚優(yōu)點(diǎn)：對(duì)樣品損傷小，耐電子束的轟擊，聚合收縮小，適合于細(xì)菌和植物組織等硬樣品，合收縮小，適合于細(xì)菌和植物組織等硬樣品， 缺點(diǎn)：不穩(wěn)定，易脆裂缺點(diǎn)：不穩(wěn)定，易脆裂生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)3水溶性包埋劑水溶性包埋劑 常用試劑：乙二醇甲基丙烯酸酯常用試劑：乙二醇甲基丙烯酸酯GMA），），聚乙二醇聚乙二醇 (PEG),甲基丙烯酸羥酸酯甲基丙烯酸羥酸酯HPMA) 注意：注意：GMA需低溫包埋，聚合時(shí)需低溫包埋，聚合時(shí)GMA和和HPMA需需 紫外照射紫外照射 應(yīng)用：適于電鏡細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)研究應(yīng)用：適于電鏡細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)研究4) 環(huán)氧樹(shù)脂類(lèi)包埋劑：環(huán)氧樹(shù)脂類(lèi)包埋劑： 特點(diǎn)：

24、聚合收縮率低，均勻，對(duì)樣品損傷小，特點(diǎn)：聚合收縮率低，均勻，對(duì)樣品損傷小，耐轟耐轟 擊，但切片困難，染色后反差小，有刺激擊，但切片困難，染色后反差小，有刺激作用作用 常用試劑：常用試劑：Epon-812 ,國(guó)產(chǎn)國(guó)產(chǎn)618，ERL4206 Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易滲透：甘油多聚酯，低粘度，易滲透 加速劑：加速劑：DMP-302，4，6三二甲基氨三二甲基氨 基甲基苯酚）基甲基苯酚） 固化劑：固化劑：DDSA十二烷基琥珀酸酐），塊十二烷基琥珀酸酐），塊軟軟 MNA六甲酸酐）六甲酸酐） ，塊硬，塊硬生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)3. 3. 常用配方：常用配方： Epon-812 Ep

25、on-812配方配方19611961，Luft)Luft) A A液：液： Epon Epon812 5ml812 5ml DDSA DDSA 8ml8ml B B液：液： Epon Epon812 5ml812 5ml MNA MNA 7ml7ml 最終：最終： A A液液1313， B B液液1515， DMP-30 16 DMP-30 16滴滴12%12%） 夏天：夏天：A A：B=2B=2：8 8A A多軟）多軟） 冬天：冬天：A A：B=1B=1：9 9B B多硬）多硬）生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)（2） 國(guó)產(chǎn)618配方: 618 12ml +DD

26、SA 8ml +DBP(增塑劑，苯二甲酸二酯丁0.61.6ml +DMP-30 0.20.4ml (13滴）（3） ERL-4206:低粘度,易滲透4, 包埋方法:常規(guī)包埋: 定向包埋: 淺槽包埋、二次包埋、加條包埋生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)（三）、聚合（三）、聚合 37（12h)45 (1248h) 60 (2448h)（四）、本卷須知 1、一切器材均須烘干 2、配制包埋劑時(shí)，逐項(xiàng)加入試劑并攪拌 3、做好的包埋塊置于干燥器中 4、配制包埋劑不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，室溫下 也有一定程度聚合生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)浸透、包埋、聚合操作圖生物電子顯微技術(shù)生物電

27、子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)五五 超薄切片超薄切片A. 載網(wǎng): 1、作用： 承載樣品,以便后續(xù)染色和觀察 2、分類(lèi) 從材料:銅,鎳,鉬,金,銀,鉑,不銹鋼, 尼龍，碳 形狀上分:圓型,蜂窩,正方形,長(zhǎng)方形 單孔型,狹逢型 大小:d=23mm,h=0.1mm 目：一英寸的線(xiàn)段上具有的孔的數(shù)目 常用180230目讓70電子束通過(guò)）（一）、載網(wǎng)和支持膜（一）、載網(wǎng)和支持膜生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)3、載網(wǎng)的特點(diǎn) 大孔徑(目數(shù)少)：電子透過(guò)率高，支持性差， 在低倍、分辨率低、大視野 場(chǎng)合下使用 小孔徑(目數(shù)多)：反之4、載網(wǎng)的清洗： 目的：清潔，除去靜電 新網(wǎng)：丙酮或乙醇浸洗，雙水

28、洗 舊網(wǎng)：溶膜酸堿,超聲,離子蝕刻生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)點(diǎn)擊返回生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)B. 支持膜的制備 1、特點(diǎn): 本身無(wú)結(jié)構(gòu) 電子透明度高 機(jī)械強(qiáng)度高,耐電子束的轟擊,穩(wěn)定性好 不與樣品發(fā)生反應(yīng) 厚度適中,150 2、常用支持膜 福爾莫瓦膜Formvar): 聚乙烯醇縮甲醛，0.2%0.5%氯仿溶液， 機(jī)械強(qiáng)度高，制作簡(jiǎn)易 火棉膠膜：強(qiáng)度低，制作簡(jiǎn)易，12 醋酸異戊酯溶液 生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù) 帕羅丁膜：30醋酸戊酯溶液，強(qiáng)度稍 高于火棉膠膜 碳膜：機(jī)械輕度高，化學(xué)穩(wěn)定好。適于 高分辨率樣品，需專(zhuān)用儀器： 真空噴鍍儀 復(fù)合膜：

29、有機(jī)膜碳膜50100） 微孔支持膜(微篩)：高分辨率用 哈氣法、甘油法、氣壓法生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)返回生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)返回生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)返回生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)返回生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)（二）、制刀（二）、制刀1、刀的種類(lèi)： 玻璃刀，鉆石刀2、玻璃刀的制作: 玻璃要求:硬,含硅高7275%), h=48mm，寬25mm、38mm，長(zhǎng)30cm 步驟：洗滌玻璃條，并晾干制成小方塊，對(duì)角折斷檢查刀刃生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù) 檢查的標(biāo)準(zhǔn)：中左端平直無(wú)缺損右端稍上翹顯微鏡下刀刃有明亮的應(yīng)力線(xiàn) 制刀的手段手工制刀，專(zhuān)用制刀機(jī)制刀L

30、KB7800)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)鉆石刀鉆石刀生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)（三）（三） 裝水槽裝水槽1. 方法方法: 裝塑料模具水槽裝塑料模具水槽 自制膠帶水槽自制膠帶水槽2. 槽液的要求槽液的要求 不與材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng)不與材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 干凈無(wú)雜質(zhì)干凈無(wú)雜質(zhì) 液面與刀口基本平行液面與刀口基本平行 低粘度低粘度,蒸發(fā)量小蒸發(fā)量小 有一定的表面張力有一定的表面張力,有利于漂浮切片有利于漂浮切片 3.常用的槽液：常用的槽液： 雙蒸水、二甲基亞砜雙蒸水、二甲基亞砜DMSO）、）、 甘油水溶液等甘油水溶液等生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技

31、術(shù)生物電子顯微技術(shù)玻玻璃璃刀刀口口的的選選擇擇生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)玻璃刀、載網(wǎng)、包埋塊及塑料模具水槽玻璃刀、載網(wǎng)、包埋塊及塑料模具水槽生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)（四修塊（四修塊1.目的目的 除去組織周?chē)嘤嗟陌窠橘|(zhì)和除去組織周?chē)嘤嗟陌窠橘|(zhì)和 不感不感 興趣的部分，以提供較大的有效觀察興趣的部分，以提供較大的有效觀察面積面積 含組織塊的區(qū)域和不含組織塊的區(qū)域含組織塊的區(qū)域和不含組織塊的區(qū)域硬度硬度 不同，經(jīng)過(guò)修塊，盡可能除去組織塊不同，經(jīng)過(guò)修塊，盡可能除去組織塊外的外的 空白包埋介質(zhì)，使要切的部分硬度一空白包埋介質(zhì)，使要切的部分硬度一致，致， 切出高質(zhì)量的切片切出高質(zhì)量的

32、切片 修成一定形狀、大小的包埋塊截面，修成一定形狀、大小的包埋塊截面，便于便于 連續(xù)切片連續(xù)切片生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)2. 修塊的方法修塊的方法 手工修塊：手工修塊： 粗修：四棱臺(tái)型粗修：四棱臺(tái)型 細(xì)修：小四棱臺(tái)塔型或二層四棱臺(tái)型細(xì)修：小四棱臺(tái)塔型或二層四棱臺(tái)型 （Mesa型），頂面積型），頂面積0.1mm2， 四個(gè)側(cè)面要整齊、規(guī)則四個(gè)側(cè)面要整齊、規(guī)則 機(jī)械修塊：機(jī)械修塊： （專(zhuān)用修塊機(jī)或超薄切片機(jī)）（專(zhuān)用修塊機(jī)或超薄切片機(jī)） 先修頂面暴露樣品先修頂面暴露樣品 后修四個(gè)側(cè)面后修四個(gè)側(cè)面生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)（五

33、）、切片（五）、切片1、超薄切片機(jī)、超薄切片機(jī) (Ultramicrotome) 按進(jìn)刀原理分為：按進(jìn)刀原理分為： 機(jī)械推進(jìn)式：機(jī)械推進(jìn)式：AO型型 熱膨脹式：熱膨脹式：I 膨脹膨脹 切片厚切片厚 LKB(，），），CQR1 冷縮式冷縮式 LKB切片機(jī)構(gòu)造切片機(jī)構(gòu)造 切片的原理切片的原理 加熱線(xiàn)圈加熱線(xiàn)圈金屬臂膨脹金屬臂膨脹推進(jìn)樣品推進(jìn)樣品 電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)樣品臂上下運(yùn)動(dòng)電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)樣品臂上下運(yùn)動(dòng)切削切削2、切片操作步驟：、切片操作步驟： 裝塊裝塊裝刀裝刀對(duì)刀對(duì)刀加水加水切片切片撈片撈片生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)返回生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)

34、生物電子顯微技術(shù)3、切片原則：、切片原則： 1刀角、前角，切速參數(shù)的選擇原則：刀角、前角，切速參數(shù)的選擇原則： 軟硬適中的包埋塊，軟硬適中的包埋塊，45刀角，刀角，35前角，前角， 25mm/s 包埋塊硬包埋塊硬,小刀角小刀角,切速小；切速??； 包埋塊軟包埋塊軟,大刀角大刀角,切速大切速大 較薄樣品較薄樣品,切速大切速大20mm/s 要獲得較大面積的切片，切速要獲得較大面積的切片，切速1mm/s 生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)2) 預(yù)先制作半薄切片的原則預(yù)先制作半薄切片的原則: 半薄切片的定義：半薄切片的定義： 切片的厚度介于普通切片和超薄切片的厚度介于普通切片和超薄切片切片 之間的切片之間

35、的切片,0.52m 半薄切片的作用：半薄切片的作用： 精確定位樣品特征位置點(diǎn)，精確定位樣品特征位置點(diǎn)， 并篩選包埋塊并篩選包埋塊生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)返回生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)4、切片厚度的判斷、切片厚度的判斷顏色厚度()切片厚度分辨率反差暗灰色400太薄高小鉛灰色400500較薄高小銀灰或銀白銀灰或銀白500700適中適中好好好好米黃、金黃7001000較厚低好紫色(藍(lán))1000以上 不能用生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)5、展片、撈片、展片、撈片6、超切注意事項(xiàng)、超切注意事項(xiàng) 切片是否成功，對(duì)刀是關(guān)鍵切片是否成功，對(duì)刀是關(guān)鍵 槽液用新鮮的

36、重蒸水槽液用新鮮的重蒸水 切片時(shí)的溫度切片時(shí)的溫度2025，相對(duì)濕度，相對(duì)濕度60%， 室內(nèi)無(wú)空氣流動(dòng)，清潔，防止震動(dòng)室內(nèi)無(wú)空氣流動(dòng)，清潔，防止震動(dòng) 不損壞封固刀槽的石蠟不損壞封固刀槽的石蠟,否則漏水否則漏水7、切片缺陷產(chǎn)生的原因及排除方法、切片缺陷產(chǎn)生的原因及排除方法生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)生物電子顯微技術(shù)六、電子染色六、電子染色1. 1. 電子染色電子染色(Electron Staining)(Electron Staining) 1) 1) 概念概念: : 利用高密度的重金屬染色劑鉛、鈾利用高密度的重金屬染色劑鉛、鈾與細(xì)胞某些微細(xì)結(jié)構(gòu)或成分結(jié)合，以增加與細(xì)胞某些微細(xì)結(jié)構(gòu)或成分結(jié)合，以增加樣品局部的電子散射能力，提高電鏡圖像樣品局部的電子散射能力，提高電鏡圖像反差的方法。反差的方