第二章基因工程基本技術(shù)原理-DNA序列

1、第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程第五節(jié)第五節(jié) DNA核酸序列分析核酸序列分析返回第二章返回第二章第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程目的與要求目的與要求掌握掌握DNA測序的一般原理和方法，通過學(xué)測序的一般原理和方法，通過學(xué)習(xí)，分析習(xí)，分析DNA策序與蛋白質(zhì)策序的區(qū)別。策序與蛋白質(zhì)策序的區(qū)別。重點：重點： Sanger雙脫氧鏈終止法策序原理和方法雙脫氧

2、鏈終止法策序原理和方法難點：難點：如何根據(jù)凝膠電泳直接讀出如何根據(jù)凝膠電泳直接讀出DNA序列序列學(xué)時：學(xué)時：2學(xué)時學(xué)時學(xué)習(xí)方法：學(xué)習(xí)方法：課堂講授與討論相結(jié)合課堂講授與討論相結(jié)合第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.1 Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法 2.5.2 MaxamGilbert化學(xué)修飾法化學(xué)修飾法 2.5.3 序列分析自動化序列分析自動化2.5.4 雜交測序雜交測序2.5.5 DNA策序的商業(yè)運作及存在問題策序的商業(yè)運作及存在問題2.5.6 思考問

3、題思考問題第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.1 Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法60年代末就已掌握了充分的理論知識，只是當(dāng)時在某些技術(shù)能力上和年代末就已掌握了充分的理論知識，只是當(dāng)時在某些技術(shù)能力上和研究思路上，存在著弱點，阻礙了從理論轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實研究思路上，存在著弱點，阻礙了從理論轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實第一，第一，如何分離寡核苷酸片段如何分離寡核苷酸片段；另一方面，在另一方面，在研究思路研究思路上都上都沒有擺脫蛋白質(zhì)序列分析的束縛沒有擺脫蛋白質(zhì)序列分析的束縛。返回返回

4、DNA核酸序列分析歷程核酸序列分析歷程第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程引物引物延伸測序策略延伸測序策略1968年華裔生物化學(xué)年華裔生物化學(xué)、生物學(xué)家吳瑞博士（生物學(xué)家吳瑞博士（DrRay Wu） 獨創(chuàng)性地設(shè)計出一種嶄新的獨創(chuàng)性地設(shè)計出一種嶄新的引物延伸測序策略引物延伸測序策略，并于，并于1971年首次成功地測定了年首次成功地測定了噬菌體兩個噬菌體兩個COS末端的完整序列；末端的完整序列；1977，F(xiàn).Sanger在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測定在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出

5、了快速測定DNA序列的末端中止法；序列的末端中止法；K. Mullis采納他的方法，完善了采納他的方法，完善了PCR擴增擴增DNA的方法；的方法；MSmith發(fā)明了堿基定點突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都發(fā)明了堿基定點突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎。獲得了諾貝爾獎。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.1 .1 Sanger雙脫氧鏈終止法原理雙脫氧鏈終止法原理利用利用DNA聚合酶的兩種酶聚合酶的兩種酶催反應(yīng)特性：催反應(yīng)特性：1、利用單鏈、利用單鏈DNA模板，合成模

6、板，合成DNA互補互補鏈；鏈；2、利用、利用2，3雙脫雙脫氧核苷三磷酸作底物，參氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從入到寡核酸鏈的末端，從而終止而終止DNA鏈的生長。鏈的生長。也也稱引物合成法稱引物合成法，或，或酶催酶催引物合成法引物合成法。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程q反應(yīng)：反應(yīng)：同時加入同時加入引物和引物和模板、模板、DNA聚合酶聚合酶1、一、一種種ddNTP、以及以及 四種四種dNTP（有一種帶放射性有一種帶放射性標(biāo)記）。標(biāo)記）。q變性膠電泳分離反應(yīng)混

7、變性膠電泳分離反應(yīng)混合物。合物。q放射自顯影術(shù)放射自顯影術(shù)，檢測單，檢測單鏈鏈DNA片段的放射性帶。片段的放射性帶。q結(jié)果判讀結(jié)果判讀，從放射性，從放射性X光 底 片 上 ， 直 接 讀 出光 底 片 上 ， 直 接 讀 出DNA的核酸順序。的核酸順序。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程GTACGTTGACGCCddATP ddTTPddGTP ddCTPddCTP ddATP ddGTP ddTTPAGTCAGGATCACC考考你考考你第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理

8、基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程酶、原料比例酶、原料比例dNTPddNTP=100：1時時，譜帶分離效果較佳，可讀出多，譜帶分離效果較佳，可讀出多于于 200個以上的核苷酸順序。個以上的核苷酸順序。降低降低dNTP對對ddNTP濃度比濃度比，會產(chǎn)生逐漸加長的片段，再配，會產(chǎn)生逐漸加長的片段，再配合使用長膠和低濃度的聚丙烯酰氨凝膠，分辨能力可提高到合使用長膠和低濃度的聚丙烯酰氨凝膠，分辨能力可提高到能判讀出能判讀出300個左右的核苷酸順序。個左右的核苷酸順序。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本

9、技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.1.2 Sanger雙脫氧雙脫氧-M13體系體系 DNA序列分析法序列分析法引物合成引物合成DNA序列測定法的特點及缺陷序列測定法的特點及缺陷分析分析：這樣處理后，能：這樣處理后，能策得高分子量策得高分子量DNA嗎？嗎？為了將這些降解的為了將這些降解的DNA片段，按其原來的順序片段，按其原來的順序“拼排拼排”起來，至少還需要用一種或數(shù)種其它內(nèi)切限制酶，對起來，至少還需要用一種或數(shù)種其它內(nèi)切限制酶，對同種同種DNA作酶切消化，并進行電泳純化和序列分析。作酶切消化，并進行電泳純化

10、和序列分析。高分子量高分子量DNA分子消化降解成一組具一定長度的限制分子消化降解成一組具一定長度的限制片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離純化，從膠中抽取分離純化，從膠中抽取DNA片段，供進一步分析。片段，供進一步分析。費時、費力、費錢、費時、費力、費錢、DNA損傷嚴(yán)重損傷嚴(yán)重第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程克服缺點的一種途徑克服缺點的一種途徑DNA分子克隆分子克隆將不同限制酶消化切割的將不同限制酶消化切割的D

11、NA限制片段，隨機地克隆到載限制片段，隨機地克隆到載體分子上。選用天然的單鏈體分子上。選用天然的單鏈 DNA噬菌體，例如噬菌體，例如 M13作為作為載體，重組體噬菌體的載體，重組體噬菌體的DNA分子，可直接用作模板。分子，可直接用作模板。引物引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是從親本單鏈?zhǔn)删w合成的特定的寡核苷酸，或者是從親本單鏈?zhǔn)删wDNA中分離出來的一種限制片段。其中分離出來的一種限制片段。其特點是能夠特異性地同載體分特點是能夠特異性地同載體分子上與克隆位點相連的單鏈子上與克隆位點相連的單鏈DNA區(qū)段雜交區(qū)段雜交。稱做。稱做“通用引物通用引物” 。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基

12、本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程M13載體克隆載體克隆DNA片段片段將將DNA片段克隆在片段克隆在M13mp載體特定載體特定LacZ區(qū)段中區(qū)段中重組體噬菌體在含有重組體噬菌體在含有IPTG和和Xgal的培養(yǎng)基平板上形成的培養(yǎng)基平板上形成白白色色的噬菌斑的噬菌斑;非重組體的噬菌體則形成非重組體的噬菌體則形成藍色藍色的噬菌斑。的噬菌斑。從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈DNA，就可以直接按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。就可以直接按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。第二

13、章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程這種隨機的方法，也需要通這種隨機的方法，也需要通過順序的測定將派生的序列過順序的測定將派生的序列拼連起來，恢復(fù)成原來結(jié)構(gòu)拼連起來，恢復(fù)成原來結(jié)構(gòu)形式的總形式的總DNA序列。序列。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程使用使用M13載體系列的優(yōu)點載體系列的優(yōu)點所有的待測定的所有的待測定的DNA片段，都可以共用一種引物。這樣，片

14、段，都可以共用一種引物。這樣，就避免了合成和分離各種不同引物的許多麻煩。就避免了合成和分離各種不同引物的許多麻煩。應(yīng)用應(yīng)用M13mp載體系列的雙脫氧鏈終止法，已經(jīng)成為一種載體系列的雙脫氧鏈終止法，已經(jīng)成為一種最普遍采用的快速最普遍采用的快速的的DNA序列分析法。序列分析法。 第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.1.3 Sanger 雙脫氧雙脫氧pUC體系體系 DNA序列分析法序列分析法將待測將待測DNA片段克隆到片段克隆到質(zhì)粒質(zhì)粒載體上，直接用載體上，直接用閉合環(huán)形

15、閉合環(huán)形的雙鏈質(zhì)粒的雙鏈質(zhì)粒DNA按雙脫氧鏈終止法作按雙脫氧鏈終止法作DNA序列分析。序列分析。這種方法特稱為這種方法特稱為利用雙鏈質(zhì)粒利用雙鏈質(zhì)粒DNA模板的雙脫氧模板的雙脫氧DNA序列分析法序列分析法。由于通常使用的質(zhì)粒多是由于通常使用的質(zhì)粒多是pUC載體系列，載體系列，所以又稱之為所以又稱之為Sanger雙脫氧鏈終止雙脫氧鏈終止-pUC體系體系DNA序列序列分析法。分析法。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程Sanger 雙脫氧雙脫氧pUC體系體系 DNA序列分析法基

16、本步驟序列分析法基本步驟待測待測DNA與與pBR322或或pUC分子分子重組重組；轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在補加：轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在補加有有Xgal-IPTG選擇性培養(yǎng)基平板上，選擇性培養(yǎng)基平板上，經(jīng)經(jīng)37過夜培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)；挑選白色菌落，挑選白色菌落，制備質(zhì)粒制備質(zhì)粒NA。堿變性處理堿變性處理，與引物一起退火，與引物一起退火，然后按雙脫氧法作序列分析。然后按雙脫氧法作序列分析。優(yōu)點優(yōu)點：無需將：無需將DNA克隆到克隆到M13載載體上，更為簡單快速，現(xiàn)已被許體上，更為簡單快速，現(xiàn)已被許多研究工作者采用。多研究工作者采用。返回目錄返回目錄第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DN

17、A-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.2 MaxamGilbert化學(xué)修飾法化學(xué)修飾法是是1977年由美國哈佛大學(xué)的年由美國哈佛大學(xué)的AMMaxam和和W Gilbert 發(fā)明的，所以又叫做發(fā)明的，所以又叫做MaxamGilbert DNA序列分析法序列分析法雖然說對于大分子量的雖然說對于大分子量的DNA片段的序列測定而言，片段的序列測定而言，化學(xué)修飾法并不如雙脫氧法方便有效，其發(fā)展速度化學(xué)修飾法并不如雙脫氧法方便有效，其發(fā)展速度也不及后者迅速，但是至今在相當(dāng)多的研究工作中也不及后者迅速，但是至今在相當(dāng)多的研究工作中仍被采用。

18、仍被采用。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.2.1 Maxam Gilbert化學(xué)修飾法的原理化學(xué)修飾法的原理化學(xué)試劑處理化學(xué)試劑處理末端標(biāo)記末端標(biāo)記DNA片段片段，堿基的特異性切割堿基的特異性切割產(chǎn)生的產(chǎn)生的DNA片段混合物片段混合物,電泳分離顯影后顯現(xiàn)譜帶，直接讀出待測電泳分離顯影后顯現(xiàn)譜帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。片段的核苷酸順序。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品

19、課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程出發(fā)材料出發(fā)材料：局部消化的：局部消化的DNA分子群體中純化出特定的分子群體中純化出特定的末端末端帶有放射性標(biāo)記的帶有放射性標(biāo)記的DNA片段片段 (雙鏈或單鏈）雙鏈或單鏈）關(guān)鍵：關(guān)鍵：4種核苷酸堿基中，有種核苷酸堿基中，有12種發(fā)生特異性的化學(xué)切割種發(fā)生特異性的化學(xué)切割僅應(yīng)，包括僅應(yīng)，包括堿基的修飾堿基的修飾、修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去以及以及在失去堿基的部位發(fā)生在失去堿基的部位發(fā)生DNA鏈的斷裂鏈的斷裂三個主要內(nèi)容。三個主要內(nèi)容。第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師

20、范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程堿基特異的化學(xué)切割反應(yīng)堿基特異的化學(xué)切割反應(yīng)肼肼（NH2NH2）肼肼能夠從能夠從 C4或或 C6位置作用于位置作用于T和和C，并用并用 C4-C5-C6環(huán)化形成一種新環(huán)環(huán)化形成一種新環(huán);進進一步作用釋放出吡唑琳酮環(huán)一步作用釋放出吡唑琳酮環(huán)，留下的留下的N1C2N3片段則仍連在糖環(huán)上。片段則仍連在糖環(huán)上。在具有在具有六氫吡啶六氫吡啶的條件下，通過的條件下，通過-消消除反應(yīng)除反應(yīng)，2個磷酸分子從糖片段上釋個磷酸分子從糖片段上釋放出來，從而導(dǎo)致放出來，從而導(dǎo)致DNA鏈斷裂。鏈斷裂。反應(yīng)體系中加入反應(yīng)體系中加入lmol/L濃度的鹽，濃度

21、的鹽，肼肼同同T的反應(yīng)速率便會逐漸下降，以確的反應(yīng)速率便會逐漸下降，以確保發(fā)生保發(fā)生C特異的化學(xué)切割反應(yīng)。根據(jù)特異的化學(xué)切割反應(yīng)。根據(jù)這一特點區(qū)別這一特點區(qū)別C和和C+T之間的降解產(chǎn)之間的降解產(chǎn)物。物。 第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程堿基特異的化學(xué)切割反應(yīng)堿基特異的化學(xué)切割反應(yīng)硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（CH3O）2SO2在在硫酸二甲酯硫酸二甲酯的作用下，堿基環(huán)的作用下，堿基環(huán)中的氮原子發(fā)生中的氮原子發(fā)生甲基化反應(yīng)甲基化反應(yīng)（G N7和和A N3）。）。中性中性PH：甲基

22、化導(dǎo)致配糖鍵甲基化導(dǎo)致配糖鍵水解水解，留下失去堿基的糖一磷酸骨架上留下失去堿基的糖一磷酸骨架上的鍵。這種鍵十分微弱，易于使的鍵。這種鍵十分微弱，易于使糖片段兩翼的糖片段兩翼的磷酸脫落，造成磷酸脫落，造成DNA斷裂斷裂;堿性堿性 pH：采用六氫吡啶同采用六氫吡啶同DNA甲甲基化反應(yīng)，而這種反應(yīng)對甲基化基化反應(yīng)，而這種反應(yīng)對甲基化的的G是特異的。因此，是特異的。因此，DNA鏈的鏈的斷裂只在斷裂只在G發(fā)生。發(fā)生。 第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.2.2 化學(xué)修飾法測序

23、圖解化學(xué)修飾法測序圖解第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程C T+C G+A ATTATCAGGATGGCGACTTCGA G+A T+C C試試看試試看你作對了嗎？你作對了嗎？第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.2.3 MaxamGilbert化學(xué)修飾法優(yōu)點化學(xué)修飾法優(yōu)點不需要體外酶催合成反應(yīng)不需要體外酶催合成反應(yīng)單雙鏈都可以單雙鏈都可以需要末端標(biāo)記需要末端標(biāo)記兩端采用不同的標(biāo)記，測序可從兩端進行兩端采用不同的標(biāo)記，測序可從兩端進行第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.3 序列分析的自動化序列分析的自動化返回目錄返回目錄第二章第二章 基因工程基本技術(shù)原理基因工程基本技術(shù)原理-DNA-DNA序列測定序列測定西北師范大學(xué)西北師范大學(xué) 精品課程精品課程 武國凡武國凡基因工程基因工程2.5.4 DNA雜交測序雜交測