非霍奇金淋巴瘤造血干細胞移植病人的微量腫瘤細胞檢測.

1、非霍奇金淋巴瘤造血干細胞移植病人的微量腫瘤細胞檢測關鍵詞： 淋巴瘤，非霍奇金氏；造血干細胞；腫瘤循環(huán)細胞/ 診斷中分類號：R733；R457文獻標識碼：A文章編號：1000-7431(2000)04-0304-03大劑量放、化療后進行自體骨髓移植 (ABMT)或外周血干細胞移植 (PBSCT)治療高?；驈桶l(fā)非霍奇金淋巴瘤 (NHL)已取得良好療效，但復發(fā)仍是治療失敗的主要原因。越來越多的證據(jù)表明，體內殘留或回輸?shù)哪[瘤細胞可導致復發(fā)，縮短病人的生存期 1 4 。因此，檢測體內和移植物中殘留的微量腫瘤細胞具有重要的臨床意義。常規(guī)的形態(tài)學檢查僅在腫瘤細胞達到 5 %以上時才能得到陽性結果 5。近年發(fā)

2、展的 PCR等分子生物學技術通過測定基因重排能在 105 106 個正常細胞中檢測到 1 個腫瘤細胞 2 4 ，從而使微量腫瘤細胞的檢測成為可能。本文就 NHL常見的基因標志、檢測方法及臨床意義作一綜述，重點討論微量腫瘤細胞檢測在 NHL病人自體造血干細胞移植中的應用。一、 NHL的基因標志1. 腫瘤細胞特異性基因標志由于染色體易位形成的基因重排，為腫瘤細胞所特有，可作為腫瘤特異性基因標志。如 NHL中，常見由 t(14 ； 18) 形成的 bcl-2/IgH 、t(11 ；14) 形成的 bcl-1/PRAD-1 及 t(8;14) 形成的 myc/IgH 基因重排，分別見于濾泡型及少數(shù)彌漫

3、性大細胞型淋巴瘤，外套細胞型淋巴瘤，小無核裂細胞型及 Burkitt's 淋巴瘤，但大部分 NHL并無這類基因標志，因此其臨床應用范圍有限。2. 腫瘤細胞克隆特異性基因標志淋巴細胞在分化成熟的過程中要進行免疫球蛋白重鏈(IgH) 或 T 細胞抗原受體 (TCR)基因重排，重排的 DNA序列具有較高的多態(tài)性及細胞克隆特異性，正常及反應性淋巴細胞為多克隆性基因重排，淋巴瘤為單克隆性 ( 偶有寡克隆 ) 基因重排，據(jù)此可區(qū)分正常細胞與腫瘤細胞。由于 IgH 和 TCR克隆性基因重排幾乎見于所有淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，故具有重要的應用價值。二、微量腫瘤細胞的檢測方法1. 非分子生物學的方法采用形態(tài)學

4、檢查或分裂中期細胞染色體核型分析，敏感性僅為1 %10 %，難以查知微量腫瘤細胞。免疫表型分析可將敏感性提高到0.1 % 。細胞培養(yǎng)的方法不僅能證實瘤細胞的存在，而且能推測這些細胞是否具有體內增殖、導致復發(fā)的能力，敏感性為 1/10 4，但缺點是所得結果難以重復 6 。2. 分子生物學的方法Southern bolt 是最早用于腫瘤基因診斷的分子生物學技術之一?？寺⌒訧gH、 TCR重排及 bcl-2/IgH 等融合基因均可用此法檢測，檢測的敏感性為1 % 5 %7。此方法有諸多缺點，如：操作復雜、有同位素污染、所需模板DNA量大且完整，故近年來已逐漸被 PCR技術所取代。與 Southern

5、 blot 相比， PCR方法敏感、簡便、快速，僅需較少量 DNA做模板，無論新鮮標本，或長期保存的石蠟包埋組織及骨髓、外周血涂片皆可進行檢測。檢測的敏感性可達到 1/10 5 1/10 6。但以共有引物 PCR方法測定淋巴瘤克隆性 IgH、TCR基因重排時，因正常淋巴細胞產生的多克隆背景干擾，敏感性下降。為了克服這種干擾，提高檢出率，可采取下列措施：a. 對來自腫瘤組織的 PCR產物測序，合成克隆特異性的寡核苷酸探針或引物，再用這一探針或引物檢測微量腫瘤細胞。此法檢測克隆性IgH CDR3重排的敏感性可達 1/10 4 。由于要對每個病人的 PCR產物測序，合成各自的克隆特異性探針或引物，難

6、度大、花費高，故不適合廣泛的臨床應用3。 b.PCR與 DNA單鏈構象多態(tài)性 (SSCP)分析結合，能在多克隆重排背景下檢出單克隆IgH 重排，敏感性為 1/1000 2/1000 ，也可在此基礎上快速克隆和測序，合成克隆特異性引物以檢測更微量的腫瘤細胞 8。 c.PCR與溫度梯度凝膠電泳 (TGGE)結合。傳統(tǒng)的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)僅根據(jù)片段大小分辨 DNA， TGGE通過兩套獨立的冷熱水循環(huán)系統(tǒng)在電泳槽上制造線性的溫度梯度，在給定的溫度下雙螺旋DNA片段部分解鏈，產生非配對的堿基，影響其電泳速率。在TGGE時同質雙螺旋體較異質雙螺旋體泳動快，從而得到一種特異的帶型。此法

7、已成功地應用于IgH 及 TCR基因重排的分析。巢式 PCR與 TGGE結合，可在 103105 個正常細胞中檢出一個腫瘤細胞 9，10。 d.PCR與變性梯度凝膠電泳 (DGGE)結合。 DGGE在聚丙烯酰胺凝膠中加入尿素做變性劑，當雙鏈 DNA片段泳動至某一凝膠區(qū)域，該區(qū)域的變性梯度與 DNA片段的低溫融解區(qū)的融解溫度相匹配時， DNA分子解鏈呈分枝狀，在凝膠中泳動減慢，形成一條滯后的帶，這樣就可分離堿基順序不同的 DNA片段。在 PAGE分析結果模棱兩可時，用 DGGE分析有意義 11 。e. 流式細胞儀或基因掃描儀檢測帶熒光標記引物的 PCR產物，敏感性為 1/10 5 12， 13

8、。f. 多對引物聯(lián)合應用可提高檢出率 3， 4， 7 。三、 NHL病人骨髓及外周血微量腫瘤細胞檢測的臨床意義1. 診斷大部分 NHL能通過病理形態(tài)學和免疫組織化學確診，少數(shù)病例從形態(tài)學上難以確診，而且一些量少、無組織結構的標本如細針抽取物、腦脊液、胸水、腹水等，僅靠細胞學難以診斷，若發(fā)現(xiàn)單克隆IgH 或 TCR基因重排、或腫瘤細胞特異性的融合基因存在，則有利于腫瘤的診斷。某些良性疾病偶爾也可發(fā)生單克隆 IgH 或 TCR基因重排，因此基因診斷必須與病理形態(tài)及免疫組化結合才能提高診斷的準確性。另外單克隆IgH 或 TCR基因重排還可以明確腫瘤細胞的來源，克隆 IgH 重排主要見于 B 細胞淋巴

9、瘤， TCR重排主要見于 T 細胞腫瘤，但在早期分化階段的細胞可以見到交叉重排現(xiàn)象。2. 分期由于檢測的高敏感性，不少作者報告在形態(tài)學檢查正常的 NHL病人的骨髓和外周血中以分子生物學技術檢出微量腫瘤細胞，提示一部分、期病人單純局部治療后可能復發(fā)的原因。 Hickish 等 14 將骨髓活檢病理、骨髓穿刺及外周血 PCR檢查的結果進行了比較，認為 PCR能將 50 %患者的分期下調，但目前尚缺乏大宗病例長期觀察、期病人骨髓和外周血 PCR測定結果。3.NHL 治療的選擇Gribben 等用 PCR檢測 102 例晚期 NHL病人治療前骨髓細胞的bcl-2重排， 70 %呈陽性；誘導或挽救治療后

10、， 50 %患者 BM形態(tài)學已呈正常，但 PCR分析仍為陽性，表明傳統(tǒng)的治療不能根除 bcl-2 重排陽性的細胞 15 。在造血干細胞移植方面，是否外周血干細胞移植 (PBSCT)優(yōu)于骨髓移植，也有不同看法。大部分作者認為： BM比 PB殘留腫瘤細胞的陽性率高，加之 PBSCT比 ABMT有造血恢復快等優(yōu)點，使 PBSCT有取代 ABMT的趨勢。但 Robert 在 60 例行 ABMT的NHL患者中，用 PCR檢測未凈化 BM采集物細胞與幾乎同時采集的外周血單個核細胞的 bcl-2 重排，發(fā)現(xiàn)兩者陽性率相似，皆為 25 %。Jacquy 等研究了 14 例期外套細胞型淋巴瘤，在多個療程化療、

11、用 G-CSF動員后采集的外周血干細胞中均檢測出 t(11 14) 陽性細胞，說明晚期 NHL，尤其某些病理類型的NHL， BM及 PB均有瘤細胞浸潤，而且動員后腫瘤細胞可能進入血循環(huán) 4 ，所以需要利用微量腫瘤細胞檢測技術進一步比較 BM與動員后所采集的外周血干細胞中瘤細胞的污染情況，以決定是進行 ABMT還是 PBSCT。4. 體外凈化效果評價Negrin 等用系列稀釋法 PCR及 DNA印跡雜交對免疫凈化前后的骨髓及外周血進行檢測，凈化前 bcl-2 陽性細胞占 1 %5 %，凈化后陽性細胞下降 3 4個對數(shù)級。 Widmer等用競爭 PCR法測有 bcl-2/IgH的 NHL病人，采集

12、的7 份骨+髓和 2 份外周血干細胞經過CD34 選擇后，污染的瘤細胞減少1 4 個對數(shù)級，其中 2 份標本 PCR轉陰，另 7 份仍含有 10200 個瘤細胞 /10 6 個單個核細胞。后 7 份標本經體外擴增 714 天， 6 例轉為 PCR陰性。5. 移植物中及治療后體內殘留的瘤細胞是否具有預測復發(fā)、判斷預后的意義。Gribben 等 1993 年報告 2 134 例有 bcl-2 易位的 B 細胞淋巴瘤，用 PCR檢測凈化效果， 121 例采集的 BM在凈化前均有瘤細胞，免疫凈化后 66 例無殘存瘤細胞， 55 例有殘存瘤細胞，經移植前者的無病生存率高于后者 (5 年無病生存率為 75

13、 %及 30 %)?；颊咭浦埠篌w內 BM的 PCR結果也與生存期有關。在 ABMT 后完全緩解期收集的 542 份 BM，其中 PCR陰性者 60 %以上無病生存期超過 5 年，陽性者平均無病生存期為 15 個月 (P 0.00001) ，而后者復發(fā)的危險性是前者的 48 倍。 58 例 PCR持續(xù)陰性及 19 例早期陽性以后轉為陰性者無一復發(fā)，PCR持續(xù)陽性或陰轉陽性者大部分病例復發(fā)， 33 例復發(fā)者復發(fā)前 BM中均查到淋巴瘤細胞。有趣的是，凈化后移植物中仍殘存瘤細胞的 55 例中， 11 例在移植后體內 BM未檢出瘤細胞，生存率比另 44 例檢出瘤細胞者高。這 11 例移植物中殘存的瘤細胞

14、可能因采集前受到過大劑量化療的損傷或宿主免疫機制的作用而喪失了克隆增殖的能力。近兩年 Caroline 、 Neuhoff 等在進行 ABMT及自體PBSCT的 NHL病人中也得到類似結果 3 。但是， Hardingdam 等 1 1995 年報告 24 例預后差的 NHL患者進行自體PBSCT，其輸入的干細胞中腫瘤標志物是否陽性與生存率無關。 Price 等觀察 15 例持續(xù)完全緩解 10 年以上的患者，其中、期患者 7 例， PCR查 bcl-2/IgH均陰性；期、期 8 例， 6 例為 PCR陽性，繼續(xù)觀察一年，所有患者仍為完全緩解期。四、結語應用分子生物學技術檢測腫瘤標志物為 NHL

15、的早期診斷、鑒別診斷、病變范圍的估計及克隆來源分析提供了一項新的手段。尤其治療后微量殘留細胞的檢測，對復發(fā)、預后的估計具有重要意義。但應注意任何實驗方法都有局限性，如：標本中正常淋巴細胞的存在使 PCR檢測的敏感性降低；所用的引物只能擴增 80 %左右的基因重排，不能包括所有病變等。目前的實驗技術尚不能精確判斷何種水平之上的殘留病變對復發(fā)具有預測價值，也不清楚 PCR陽性持續(xù)多長時間便應給予治療。雖然大多數(shù)研究提示，殘留病變可導致復發(fā)、降低生存率，但少數(shù)有殘留病者仍能長期生存。這些問題皆有待進一步研究。( 本文編輯：戴峰)作者簡介：李振玲，女，在讀碩士，主治醫(yī)師。作者單位：李振玲（中國醫(yī)學科學

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