六君子湯對(duì)環(huán)磷酰胺的增效減毒作用研究

1、六君子湯對(duì)環(huán)磷酰胺的增效減毒作用研究                      作者：劉智勤，朱惠學(xué)，陳鵲汀 蔣玉鳳，孫宏麗，黃啟?！菊?#160; 目的探討六君子湯對(duì)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）的增效減毒作用。方法建立S180荷瘤小鼠模型后，隨機(jī)分為4組，即荷瘤對(duì)照組、CTX組、六君子湯高劑量+CTX組、六君子湯低劑量+CTX組，每組10只。造模次日開(kāi)始給藥

2、，共10 d，停藥次日處死，觀察荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況及對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)和抗氧化酶的影響。結(jié)果六君子湯可提高CTX的抑瘤率及血清SOD、GSHpx活性，降低MDA含量，同時(shí)還能增強(qiáng)化療荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力和殺傷細(xì)胞(NK)活性 (P<0.05)。結(jié)論六君子湯對(duì)化療藥物CTX具有增效減毒的作用，其作用可能是通過(guò)提高免疫系統(tǒng)功能和抗氧化功能實(shí)現(xiàn)的。 【關(guān)鍵詞】  六君子湯 環(huán)磷酰胺 增效減毒 腫瘤化療Abstract：ObjectiveTo observe the synergy and attenuation of cyclophosphamidum(CTX) activit

3、ies by LiuJunZi Decoction.MethodsS180 tumor bearing mice models were established and then divided randomly into four groups，including control group with tumor，CTX group， LiuJunZi Decoction (high and low dose) combined with CTX groups. Each group had 10 mice. After 10 days of treatment，the mice in th

4、e four groups were all killed. The effects of LiuJunZi Decoction on tumor weight，immune function and antioxidative enzyme were measured respectively. Results LiuJunZi Decoction could promote spleen lymthocyte proliferation，NK activity and increase tumor-weight-inhibiting rates，activity of SOD，GSH-pX

5、，and decreased the concentration of MDA significantly compared with CTX group(P<0.05).ConclusionThe synergy and attenuation of LiuJunZi Decoction can be attributed to improve immune function and anti-oxidative capacity.Key words：LiuJunZi Decoction；   Cyclophosphamide；   Synerg

6、y and Attenuation；  Tumor  Chemotherapy    腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類生命健康的常見(jiàn)病。當(dāng)前對(duì)腫瘤的仍是以手術(shù)為主的綜合治療，其中術(shù)后化療是預(yù)防轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要治療手段，然而化療常引起如臟器損害和免疫力低下等毒副反應(yīng)，使患者難以堅(jiān)持治療。近年來(lái)的研究顯示，中醫(yī)藥在支持患者完成化療療程、增強(qiáng)療效、防止毒副反應(yīng)上有著重要的作用，臨床運(yùn)用廣泛。六君子湯源自婦人良方，主治脾胃氣虛兼有痰濕，癥見(jiàn)惡心嘔吐、胸脘痞悶、四肢無(wú)力等癥狀，其所治療諸癥恰恰為化療中常見(jiàn)，但六君子湯在腫瘤化療中的增效減毒作用報(bào)道較少，且缺乏系統(tǒng)性

7、和規(guī)范性。本研究通過(guò)建立S180荷瘤小鼠模型，探討六君子湯聯(lián)合化療藥物環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）治療腫瘤是否具有減毒增效作用，以期為該方的臨床應(yīng)用提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1   材料與儀器1.1  動(dòng)物和瘤株 清潔級(jí)昆明小鼠40只，810周齡，雌雄各半，體重1822 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)704113。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周。飼料和墊料由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間自由采食飲水。腹水型S180瘤株由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，L929細(xì)胞株由北京市中醫(yī)研究所提供。 1.2  

8、 藥物六君子湯主要由人參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏等藥物組成，由河北大學(xué)附屬中藥房提供，所有藥品均經(jīng)中藥專家鑒定。取上述中藥自來(lái)水浸泡1 h后，分別加8，6，4倍量的水煎煮3次，時(shí)間分別為藥液熬開(kāi)后40，30，20 min，將3次煎煮的藥液混合，離心，取上清，80 水浴濃縮至每毫升含生藥0.8   g，高溫消毒后置4冰箱保存?zhèn)溆?。化療藥物為注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)06112021)。1.3  試劑RpMI1640完全培養(yǎng)基(Amresco公司產(chǎn)品)，四氮甲唑藍(lán)(MTT，Amresco公司產(chǎn)品)，DMSO(Amresco公司產(chǎn)品)，刀豆蛋白

9、A(ConA，Sigma公司產(chǎn)品)。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。1.4  儀器 酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司產(chǎn)品），CO2培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品），超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，倒置顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司產(chǎn)品）。AE240天平（梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品）。22pC分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品）。2  方法2.1  動(dòng)物模型的建立1 無(wú)菌條件下抽取傳代第8天的S180小鼠的腹水，按1:3比例用生理鹽水稀釋，反復(fù)沖打、充

10、分混勻，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，取0.2 ml于每鼠右側(cè)腋窩下碘酊消毒后皮下接種。瘤株接種前，均用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞數(shù)為95%98%。從抽取腹水時(shí)開(kāi)始，到移植完最后一只小鼠的總時(shí)間控制在60 min內(nèi)。2.2  分組及給藥小鼠接種24 h后按體重和性別隨機(jī)分成荷瘤對(duì)照組、CTX組、六君子湯（高、低劑量）+CTX組。荷瘤對(duì)照組用生理鹽水灌胃，CTX組腹腔注射CTX 0.02 g·kg-1·d-1，同時(shí)用生理鹽水灌胃，六君子湯高、低劑量+CTX組的化療藥物劑量、給藥途徑及時(shí)間與CTX組相同，六君子湯高、低劑量分別給予

11、16，4 g·kg-1·d-1（按生藥量計(jì)算，劑量由預(yù)實(shí)驗(yàn)得出）灌胃，各組灌胃容積均為0.2 m1/10g，1次/d，連續(xù)10 d。各組于瘤細(xì)胞接種后第2天開(kāi)始用藥，于實(shí)驗(yàn)第12天眼球采血后處死小鼠，取脾臟、腫瘤檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。 2.3  抑瘤率計(jì)算于實(shí)驗(yàn)第12天，將各組小鼠眼球采血后處死，稱重，依次用碘酊酒精消毒操作部位皮膚，于超凈工作臺(tái)上，以無(wú)菌操作從腋部皮下完整剝?nèi)∧[瘤組織，剝離干凈后于電子天平稱瘤體重量并按公式計(jì)算抑瘤率2。    抑瘤率（%）=（對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重/對(duì)照組瘤重）×100% 2.

12、4  NK細(xì)胞活性測(cè)定3無(wú)菌摘取脾臟，按常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的RpMI1640培養(yǎng)液配成1×107 /ml濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。取傳代培養(yǎng)的L929細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液消化2 min，加入完全RpMI1640培養(yǎng)液，調(diào)細(xì)胞濃度為2×105/ml作為靶細(xì)胞，在96孔平底板上每孔加入靶細(xì)胞懸液100 l，37、5%CO2培養(yǎng)90 min，使其貼壁成單層細(xì)胞，然后實(shí)驗(yàn)孔加入100 l效應(yīng)細(xì)胞懸液，做4個(gè)復(fù)孔，靶細(xì)胞對(duì)照孔加完全RpMI1640培養(yǎng)液100 l；然后將96孔板放在37 ，5%CO2孵箱中孵育20 h，去上清，用生理鹽水輕輕注滿各孔，反

13、復(fù)3次，以除去效應(yīng)細(xì)胞和被殺傷脫落的靶細(xì)胞，在濾紙上吸干孔內(nèi)水分；每孔加入0.1%的中性紅染液100 l，孵育30 min，棄去染液，用生理鹽水洗3遍，每孔加100 l細(xì)胞裂解液（1:1的冰醋酸和無(wú)水乙醇），使含有中性紅的靶細(xì)胞溶解，搖勻，用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)OD值，用以下公式計(jì)算殺傷率。    殺傷率(%)=(靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/靶細(xì)胞OD值×100%2.5  T淋巴細(xì)胞增殖能力的測(cè)定4  無(wú)菌摘取脾臟，常規(guī)制作脾細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的RpMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度至5×106L，加入96

14、孔細(xì)胞培養(yǎng)板100 l/孔，再分別加入ConA 100 l/孔使其終濃度為6 g/ml，將上述加好的培養(yǎng)板置37、5%CO2培養(yǎng)箱68 h，取出，每孔吸出10l，加0.5 g/L MTT 10 L/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)4 h，取出，加10%SDSHCL溶液100 l/孔，振蕩過(guò)夜，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD)值。以各樣本A值代表其T淋巴細(xì)胞增殖能力。2.6   抗氧化酶測(cè)定荷瘤小鼠血清SOD，GSHPx和MDA含量的測(cè)定嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。2.7   統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)以±s表示，采用SpSS11.5 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行

15、分析，多組間比較用OneWay ANOVA方差分析，P0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1         3  結(jié)果 3.1  六君子湯對(duì)化療荷瘤小鼠一般狀況的影響 小鼠接種瘤細(xì)胞前，神情佳，被毛光澤，能自動(dòng)覓食和飲水。瘤細(xì)胞接種后4 d，于小鼠右腋下接種部位可觸及米粒大小的瘤結(jié)節(jié)，之后逐漸長(zhǎng)大。CTX組及六君子湯各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)的勢(shì)頭均不及荷瘤對(duì)照組。CTX組在腹腔注射CTX后，狀況明顯不及荷瘤對(duì)照組，小鼠出現(xiàn)毛無(wú)光澤而稀疏脫落，少動(dòng)，懶于覓食，且這種狀況日益加重，而六君子湯治療組上述狀況較輕。3.2

16、  六君子湯對(duì)化療荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響 由表1可以看出，CTX組、六君子湯高、低劑量組的瘤重與荷瘤對(duì)照組相比差異顯著（P0.01）；CTX組有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，抑瘤率達(dá)45.67%；六君子湯高、低劑量+CTX組抑瘤率分別可達(dá)54.49%和50.54%，CTX組與六君子湯高劑量+CTX組相比差異顯著（P0.05）。3.3   六君子湯對(duì)化療荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響 荷瘤小鼠用CTX化療后脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活力及NK細(xì)胞殺傷活性均下降，而CTX聯(lián)合六君子湯治療后荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)和NK細(xì)胞殺傷活性均有所提高，與CTX組比較差異顯著(P<0.05

17、)。3.4  六君子湯對(duì)化療荷瘤小鼠血清抗氧化系統(tǒng)功能的影響荷瘤小鼠用CTX聯(lián)合六君子湯治療后血清SOD，GSHPx活力明顯升高，MDA含量下降，與CTX組比較差異顯著(P<0.05)。表1  六君子湯對(duì)化療小鼠瘤重及抑瘤率的影響（略）與荷瘤對(duì)照組比較,*p0.01；與CTX組比較,P0.05 ；n=10表2  六君子湯對(duì)化療荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷率和淋巴細(xì)胞增殖的影響（略）與CTX組比較P0.05 ，P0.01；n=10表3  六君子湯對(duì)化療荷瘤小鼠血清SOD，GSHPx，MDA的影響（略）與CTX組比較P0.05；n=104  討論&#

18、160;   六君子湯源自婦人良方，功善健脾益氣，燥濕化痰，和胃消痞，降逆止嘔。方中人參為君，甘苦溫相用，大補(bǔ)元?dú)?，益助脾胃；白術(shù)為臣，甘苦溫相用，補(bǔ)氣健脾，溫中燥濕；茯苓為佐，甘淡平相用，滲濕健脾；陳皮健脾和中，行氣止痛；半夏化痰濕、補(bǔ)脾氣；甘草調(diào)中，補(bǔ)益脾胃之氣。諸藥合用標(biāo)本兼顧，培正固本，從而可預(yù)防和改善諸種化療副反應(yīng)，提高患者化療期間的生活質(zhì)量。藥研究證實(shí)5，六君子湯不僅具有抗腫瘤作用，還可調(diào)節(jié)免疫功能，保護(hù)臟器免受有害毒物損傷。本研究通過(guò)觀察六君子湯聯(lián)合CTX抗S180荷瘤小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，六君子湯高劑量聯(lián)合CTX組腫瘤抑制率高于CTX組，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)六君子湯對(duì)CTX

19、引起的荷瘤小鼠毛發(fā)無(wú)光澤、稀疏脫落，少動(dòng)，懶于覓食等狀況有改善作用，提示六君子湯對(duì)CTX抗移植瘤生長(zhǎng)具有一定增效減毒作用。    腫瘤患者的免疫功能與腫瘤的發(fā)生和密切相關(guān) 6，7。腫瘤的存在抑制機(jī)體免疫功能8，而化療藥物應(yīng)用可加重機(jī)體的免疫抑制。因此提高腫瘤患者的免疫功能，尤其是化療后出現(xiàn)的嚴(yán)重免疫功能抑制，成為抗腫瘤治療的一個(gè)主要方面。在抗腫瘤免疫方面，細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位，T細(xì)胞為細(xì)胞免疫的主要方面，是機(jī)體抗腫瘤免疫的核心力量，T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)率是一個(gè)能夠代表機(jī)體免疫能力的重要免疫因素9。NK細(xì)胞是細(xì)胞免疫中的非特異性成分，主要發(fā)揮免疫監(jiān)視功能和抗腫瘤作用，它

20、不僅可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，也可以通過(guò)產(chǎn)生IL2、干擾素等增強(qiáng)其他細(xì)胞的抗腫瘤作用，在機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用。因此NK細(xì)胞殺傷活性可有效地反映機(jī)體的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠應(yīng)用CTX后T淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞殺傷活性均下降，而CTX聯(lián)合六君子湯治療后，二者均有所升高，提示六君子湯可對(duì)抗化療藥物CTX所致的免疫抑制，促進(jìn)機(jī)體免疫功能的恢復(fù)，從而可提高機(jī)體的抗腫瘤作用。    自由基的研究屬于新興的亞分子生物學(xué)范疇，機(jī)體內(nèi)自由基的含量與腫瘤的關(guān)系非常密切。SOD和GSHPx是體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD的主要作用是清除體內(nèi)氧自由基，防止活性氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。G

21、SH的作用是防止脂質(zhì)過(guò)氧化物形成。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化物的終產(chǎn)物，測(cè)試MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。癌癥的發(fā)生發(fā)展與氧化損傷密切相關(guān)。有資料顯示，腫瘤組織中過(guò)氧化脂質(zhì)增加，而抗氧化物酶的活性下降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)六君子湯可提高化療荷瘤小鼠血清SOD活性與GSHPx水平，降低MDA的含量，提示六君子湯可提高化療小鼠的抗氧化酶活性和減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成，從而可清除體內(nèi)自由基，減輕氧化損傷的程度。    綜上所述，六君子湯與化療藥物CTX合用具有增效減毒作用，其作用可能是通過(guò)提高機(jī)體免疫力和抗氧化系統(tǒng)功能兩途徑實(shí)現(xiàn)的。這為六君

22、子湯在腫瘤化療中的應(yīng)用提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【】  1 陳鵲汀，劉智勤，蔣玉鳳，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)化療藥物5Fu增效減毒的實(shí)驗(yàn)研究J.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（11）:757.2 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，第2版M.上海:上海技術(shù)出版社，2006:777.3 付 于，夏 天消瘤湯治療腫瘤及調(diào)節(jié)免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究J.中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，2（12）:1114.4 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)，第2版M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006:748.5 沈映君.中藥藥理學(xué)M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000:958.6 Kastelan Z， Lukac E， Derzic D， et a