中藥病毒寧滴劑抗呼吸道病毒作用的研究

1、    中藥病毒寧滴劑抗呼吸道病毒作用的研究         摘要：病毒寧滴劑為廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所和北京市宇維生科貿(mào)技術(shù)有限公司聯(lián)合研制的、主要用于外感風(fēng)熱初起型感冒的中藥滴鼻制劑，該藥由柴胡、甘草等藥組成。為探討其抗病毒作用，從體內(nèi)外抗病毒實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒寧滴劑抗呼吸道病毒作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：在5種培養(yǎng)細(xì)胞上病毒寧滴劑20g/L濃度組對(duì)7種呼吸道病毒毒株均有明顯的抑制病毒致細(xì)胞病變的作用。體內(nèi)試驗(yàn)表明，病毒寧滴劑100g/L濃度滴鼻0.05mL/(鼠.次)，每天2

2、次，對(duì)流感病毒引起的小鼠肺炎實(shí)變有明顯的抑制作用，200g/L、100g/L濃度組能抑制流感病毒增殖(與病毒對(duì)照組比較，P0.05或P0.01)，200g/L濃度組能延長(zhǎng)流感病毒感染的小鼠生存時(shí)間。主題詞：病毒寧滴劑/藥理學(xué)；病毒寧滴劑/投藥和劑量；感冒/中藥療法；辛涼解表劑/治療應(yīng)用；正粘病毒A型/藥物作用；呼吸道合胞病毒/藥物作用；鼻病毒屬/藥物作用；小鼠中分類號(hào)：R373.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3213(1999)02-0130-05Antiviral Effects of Bingdu Ning Drop in Respiratory TractDENG Xuelong1

3、，ZHUYutong1,HUANG Zhengyan2，F(xiàn)U Linchun1，LI Yushu3，LIU Ni1，HU Yingjie1,LI Guoqiao1(1.Tropical Medigine Institute, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China; 2.Dept. of Electron Microscope, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405 ,China; 3.Yuwei Bioscience of Beijing Trade Ltd. Co，Bei

4、jing 100850， China)AbstractAntiviral effects of Bingdu Ning Drop (BND) in the respiratory tract were studied both in vivo and in vitro. The experiment in vitro showed that BND at the concentration of 20mg/mL obviously inhibited the cytopathy of seven kinds of respiratory tract virus strains cultured

5、 in five kinds of culture cells.Experiments in vivo showed that BND at the concentration of 100g/L for the intranasal treatment (0.05mL twice daily) markedly inhibited the lung consolidation of mice with pneunonitis caused by the infection of influenza virus. BND at the concentrations of 200g/L and

6、100g/L significantly inhibited the proliferation of influenza virus (P0.05 or P0.01) as compared with the control group, and prolonged the survival time of mice infected with influenza virus at the concentration of 200g/L.Key wordsBINGDU NING DROP/ pharmacology;BINGDU NING DROP/AD；COMMON COLD/TCD th

7、erapy;PUNGENT-COOL DIAPHORETIC AGENT/ther. use;ORTHOMYXOVIRUSES TYPE A/drug effects;RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUSES/drug effects;RHINOVIRUS/drug effects; MICE引起感冒病因較多，常見(jiàn)如鼻病毒、流感病毒、腺病毒等，而合成藥中尚無(wú)理想廣譜的能消除癥狀的抗病毒藥物問(wèn)世1。病毒寧滴劑是由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所和北京市宇維生科貿(mào)技術(shù)有限公司聯(lián)合研制，該藥由柴胡、甘草等藥組成，具有辛涼解表，宣肺通竅之功效，主要用于外感風(fēng)熱初起，癥見(jiàn)惡寒發(fā)熱，鼻塞，噴

8、嚏，咽干咽痛等。為研究其抗病毒作用，我們選擇了包括鼻病毒在內(nèi)的7種呼吸道病毒，從體外、體內(nèi)進(jìn)行了抗病毒作用研究。1實(shí)驗(yàn)材料1.1藥物病毒寧滴劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所藥化制劑室提供，批號(hào) 961001，病毒寧所用濃度均按每升相當(dāng)于含生藥量多少克表示。病毒唑由湖北省醫(yī)工所提供，批號(hào) 950303。1.2動(dòng)物NIH小白鼠由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第26-026，雌雄不拘，體重1416g。1.3毒種1.3.1鼻病毒鼻病毒R14型由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所分贈(zèng)。原毒種為美國(guó)ATCC提供，在國(guó)家鑒定之KMB17雙倍體細(xì)胞中傳代，于33，5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。1.3.2流感病毒流感病毒FM1株

9、由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，于MDCK狗腎細(xì)胞傳代，以病變及豚鼠紅血球血凝法來(lái)判斷其滴度，在35，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1.3.3呼吸道合胞病毒毒種由廣州市兒童醫(yī)院病毒實(shí)驗(yàn)室提供，為RSV-N3株，于Hep-2細(xì)胞或Hela細(xì)胞上擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)定。1.3.4腺病毒3型毒種來(lái)源同呼吸道合胞病毒，并于Hela細(xì)胞上傳代，滴定與檢測(cè)。1.3.5皰疹病毒型與型毒種來(lái)源同呼吸道合胞病毒，在BHK細(xì)胞上傳代與檢測(cè)。1.3.6副流感病毒3型毒種來(lái)源同呼吸道合胞病毒，于Hela細(xì)胞及KMB17細(xì)胞上用豚鼠紅血球血吸附法檢測(cè)。1.4細(xì)胞人肺KMB17原代細(xì)胞株第18代，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明生物制品研

10、究所分贈(zèng)；狗腎細(xì)胞株(MDCK)，由廣東省防疫站病毒室贈(zèng)送；地鼠腎細(xì)胞株(BHK)，由廣州市兒童醫(yī)院病毒實(shí)驗(yàn)室提供；Hep-2細(xì)胞和Hela細(xì)胞，為本所病毒實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株。1.5免疫血清用雞胚尿囊液傳代的流感病毒 FM1 株免疫家兔，獲得高效價(jià)的免疫血清 (血凝抑制效價(jià)11280)，置-40冰箱保存，用前測(cè)定抗體效價(jià)。1.6標(biāo)記抗體由華美公司的羊抗兔IgG-FITC，置4保存，用時(shí)以115稀釋。1.7細(xì)胞培養(yǎng)液和維持液各為含10%、2%小牛血清、100kU/L青霉素、鏈霉素的DMEM(GIBCOBRL公司產(chǎn)品)。2方法2.1對(duì)病毒致細(xì)胞病變的體外抗病毒作用以上抗病毒試驗(yàn)在96孔微量板上進(jìn)行，

11、每孔0.1mL，細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，長(zhǎng)成單層后，將病毒寧藥液用維持液稀釋成不同濃度，拋掉原培養(yǎng)液后將不同濃度病毒寧藥液加入細(xì)胞孔中，0.1mL/孔，以細(xì)胞不出現(xiàn)病變的最小稀釋度為該藥液對(duì)細(xì)胞無(wú)毒界限。通過(guò)毒性試驗(yàn)觀察到病毒寧20g/L和病毒唑1g/L濃度對(duì)5種細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，同時(shí)在相應(yīng)敏感細(xì)胞上測(cè)定攻擊病毒之TCID50。試驗(yàn)時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照、藥物毒性對(duì)照及三氮唑核苷(病毒唑)對(duì)照，置33或37CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每天在倒置顯微鏡下觀察病變并記錄。當(dāng)病毒對(duì)照孔細(xì)胞出現(xiàn)+病變時(shí)，繼續(xù)觀察4d則終止。細(xì)胞出現(xiàn)病變的程度按以下6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄：-：細(xì)胞生長(zhǎng)正常，無(wú)病變出現(xiàn)；±

12、：細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10%；+：細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25%；+：細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50%；+：細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%；+：細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上。2.2對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的影響將體重為1416g的NIH小鼠隨機(jī)分組，藥物組于感染前1d開(kāi)始滴鼻給藥，0.05mL/次，2次/d，連續(xù)5d，對(duì)照組給予同容積蒸餾水滴鼻。各組在乙醚輕度麻醉下感染流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM115LD50，感染后96h處死，稱體重后取肺稱重，逐個(gè)算出肺指數(shù)值(每100g體重的肺質(zhì)量，即肺指數(shù)=肺質(zhì)量/體重×100)和肺指數(shù)抑制率(病毒對(duì)照組平均肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))

13、/病毒對(duì)照組平均肺指數(shù)×100%，與對(duì)照組比較進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。2.3對(duì)小鼠體內(nèi)流感病毒增殖的影響在乙醚輕度麻醉下以流感病毒FM11000LD50量感染小鼠，人工感染前1d開(kāi)始滴鼻給藥，2次/d， 0.05mL/只。在感染后48h，解剖取肺，固定，制成組織切片，脫臘，先以 FM1兔免疫血清(HAI 11280)浸染，沖洗后再加115稀釋的羊抗兔IgG熒光抗體(華美生物工程公司生產(chǎn))，于熒光顯微鏡下觀察整個(gè)切片所有的細(xì)支氣管數(shù)量，計(jì)算含有特異性熒光顆粒的細(xì)支氣管數(shù)量，計(jì)算各組細(xì)支氣管內(nèi)含特異性熒光顆粒百分率(出現(xiàn)特異性熒光顆粒的細(xì)支氣管數(shù)量/計(jì)數(shù)的細(xì)支氣管總數(shù)×100%)，熒光

14、陽(yáng)性率高表明病毒顆粒增殖多，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理7。2.4對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒的死亡保護(hù)和延長(zhǎng)病鼠生命的作用將小鼠隨機(jī)分為病毒對(duì)照組和病毒寧200g/L組，分別以FM12LD50滴鼻感染，給藥組自感染病毒前1d開(kāi)始到感染后4d，共滴鼻給藥0.05mL/次，2次/d，病毒對(duì)照組滴鼻給予等量蒸餾水，逐日觀察動(dòng)物發(fā)病和記錄死亡數(shù)，共觀察14d，計(jì)算死亡保護(hù)率(對(duì)照組死亡率-給藥組死亡率)×100%、延長(zhǎng)生命率(給藥組平均存活日數(shù)-對(duì)照組平均存活日數(shù))/對(duì)照組平均存活日數(shù)×100%。3結(jié)果3.1對(duì)病毒致細(xì)胞病變的體外抗病毒作用表1結(jié)果表明：在病毒寧20g/L濃度下，即較臨床應(yīng)用濃度稀

15、釋5倍情況下仍可對(duì)鼻病毒、流感病毒產(chǎn)生較好的抑制病變作用，較病毒唑更具廣譜作用。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，結(jié)果與表1完全一致。3.2對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的影響表2結(jié)果表明：病毒寧組按100g/L濃度每次滴鼻0.05mL,2次/d的劑量對(duì)小鼠流感病毒性肺炎有顯著治療作用，其療效優(yōu)于1.05g/L病毒唑組的。3.3對(duì)小鼠體內(nèi)流感病毒增殖的影響表3結(jié)果表明：病毒對(duì)照組出現(xiàn)特異性熒光率為61%，而病毒寧200g/L和100g/L組熒光率分別為9.5%與20%(P0.01)，且呈量效關(guān)系；病毒唑(1.05g/L)滴鼻亦有一定抑制作用，但效果不如病毒寧明顯。3.4對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒的死亡保護(hù)和延長(zhǎng)病鼠生命的作用

16、表4結(jié)果表明：病毒寧200g/L組對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒有死亡保護(hù)和延長(zhǎng)病鼠生命的作用。4討論呼吸道病毒感染首先入侵鼻咽、口咽、喉部和扁桃體的局部粘膜和粘膜下，在這些部位復(fù)制并釋放病毒顆粒和毒素而引起感冒癥狀。由于僅引起呼吸道局部表面感染，除腺病毒外，所產(chǎn)生的抗體量少，故再感染經(jīng)常發(fā)生2。因此直接在鼻咽和口咽部給予抗病毒滴劑藥物，可以直接作用于感染靶位，收到較好的療效，給藥劑量較口服途徑小數(shù)十到數(shù)百倍，方便實(shí)用且有宣通開(kāi)竅，消除癥狀的作用。我國(guó)自古代就有許多局部鼻咽給藥的報(bào)道3，但目前尚未有類似抗感表2病毒寧對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的作用組別N/只濃度/(g.L-1)K肺指數(shù)值/(<&quo

17、t;1901 (124 bytes)" src="/med/cano/201003/20100323183743882" 13 14>±s)p抑制/%病毒對(duì)照8-1.58±0.47-正常對(duì)照10-0.94±0.10-病毒唑121.051.17±0.2625.95*病毒寧111001.00±0.1936.71*病毒寧15501.20±0.3824.05*病毒對(duì)照9-1.73±0.46-正常對(duì)照9-1.02±0.29-病毒唑91.051.21±0.2330.06*病毒寧10

18、1001.17±0.3432.37*病毒寧10501.43±0.5017.34病毒寧9251.63±0.565.78     *與病毒對(duì)照組比較P0.05，*P0.01 表3病毒寧對(duì)流感病毒增殖的影響組別N動(dòng)物/只濃度/(g*L-1)N有/條N無(wú)/條N總/條p/%2P值病毒對(duì)照11-20213133361-病毒寧12200383613999.52150.01病毒寧1210080314394201230.01病毒唑121.0517422840243200.01     N有：含有特異性熒

19、光顆粒的細(xì)支氣管數(shù)量；N無(wú)：沒(méi)有特異性熒光顆粒的細(xì)支氣管數(shù)量；N總：各組細(xì)支氣管總數(shù)；p=N有/N總 表4病毒寧對(duì)小鼠體內(nèi)感染流感病毒的死亡保護(hù)作用組別N總/只N死亡/只p死亡/%p死亡保護(hù)/%t平均存活/d病毒對(duì)照組10880-10.7病毒寧200g/L組1033050*13.5*     *與病毒對(duì)照組比較P0.05，*P0.01 表1病毒寧對(duì)病毒致病變抑制作用病毒株靶細(xì)胞XTCLD50不同質(zhì)量濃度()對(duì)病毒的抑制作用1=20g.L-12=10g.L-13=5g.L-14=1g.L-1鼻病毒R14型KMB1730+-流感病毒A型FM1MDCK100+

20、-+呼吸道合胞病毒Hep-2100+腺病毒3型Hela100+±-皰疹病毒型BHK100+皰疹病毒型BHK100+-副流感3型KMB17100+-+     +：表示抑制；±：表示不肯定；-：表示不抑制冒病毒滴劑在臨床應(yīng)用。引起感冒等急性上呼吸道感染的主要病毒，除鼻病毒外，尚有腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腸道病毒的柯薩奇A21、A24、A1-10、ECHO19、20等等。Reed估計(jì)50%的感冒為鼻病毒和呼吸道合胞病毒引起，其余則為腸道病毒等所致4。我國(guó)的感冒病人中除鼻病毒外則以流感病毒感染較為多見(jiàn)，并且呈周期性大流

21、行，嚴(yán)重威脅著人類健康。目前西方和國(guó)內(nèi)臨床用于抗A型流感病毒的藥物有金剛烷胺(amatadine)、甲基金剛烷胺(rimantadine)、病毒唑(virazole)和干擾素等，前二者可引起中樞性眩暈和迅速耐藥毒株的出現(xiàn)1；而低劑量口服病毒唑1.0g/d無(wú)明顯抗病毒作用，大劑量口服對(duì)無(wú)并發(fā)癥流感患者退熱與癥狀消除的作用較快5，但大劑量口服的毒性較大，且對(duì)B型流感無(wú)治療作用；干擾素在預(yù)防鼻病毒方面是有效的，而對(duì)流感和副流感的感染者的治療效果，目前看法不一。應(yīng)用祖國(guó)醫(yī)學(xué)中草藥治療流感有數(shù)千年歷史，臨床有效的方藥不少，但有許多缺乏現(xiàn)代病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。5070年代，國(guó)內(nèi)曾用體外方法對(duì)大量的中草藥進(jìn)行篩

22、選，有人統(tǒng)計(jì)425種中草藥在體外細(xì)胞水平對(duì)流感病毒有抑制作用者達(dá)67種，占15.5%6。但其后能通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)有肯定的抑制流感病毒者不多，有明確的現(xiàn)代病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的中藥有正柴胡飲7、清肺飲8、魚(yú)腥草醇提物9等。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒寧20g/L濃度組在體外細(xì)胞水平有廣譜抑制呼吸道病毒的作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明其有抗小鼠流感病毒性肺炎和抑制小鼠體內(nèi)流感病毒增殖的作用，且呈量效關(guān)系；并可延長(zhǎng)流感病毒感染小鼠的存活時(shí)間。這些都表明病毒寧滴劑對(duì)病毒性感冒的病因治療具有良好的前景，關(guān)于其在抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛與對(duì)免疫系統(tǒng)作用的研究將在另文報(bào)導(dǎo)。 作者簡(jiǎn)介：第一作者，男，助理研究員作者單位：鄧學(xué)龍朱宇同符林春劉妮胡英杰李國(guó)橋廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研