甲型肝炎滅活疫苗(人二倍體細(xì)胞)

1、甲型肝炎滅活疫苗（人二倍體細(xì)胞）Jiaxing Ganyan Miehuoyimiao （Ren Erbeiti Xibao） Hepatitis A Vaccine(Human Diploid Cell), Inactivated 本品系用甲型肝炎病毒（簡(jiǎn)稱(chēng)甲肝）接種人二倍體細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲，病毒純化、滅活和氫氧化鋁吸附后制成。用于預(yù)防甲型肝炎。1基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合“凡例”有關(guān)要求。2.制造21生產(chǎn)用細(xì)胞生產(chǎn)用細(xì)胞為人二倍體細(xì)胞（2BS株、KMB17株或其他經(jīng)批準(zhǔn)的細(xì)胞株）。2.1.1 細(xì)胞庫(kù)管理及檢定應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)和檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備

2、及檢定規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。取自同批工作細(xì)胞庫(kù)的1支或多支細(xì)胞管， 經(jīng)復(fù)蘇擴(kuò)增后的細(xì)胞僅用于一批疫苗的生產(chǎn)。2BS細(xì)胞株原始細(xì)胞庫(kù)應(yīng)不超過(guò)第14代，主細(xì)胞庫(kù)應(yīng)不超過(guò)第31代，工作細(xì)胞庫(kù)次應(yīng)不超過(guò)第44代。KMB17株原始細(xì)胞庫(kù)應(yīng)不超過(guò)第6代，主細(xì)胞庫(kù)應(yīng)不超過(guò)第15代，工作細(xì)胞庫(kù)應(yīng)不超過(guò)第45代。212 細(xì)胞制備取工作細(xì)胞庫(kù)中的1支或多支細(xì)胞管，經(jīng)復(fù)蘇、 擴(kuò)增制備的一定數(shù)量并用于接種病毒的細(xì)胞為一個(gè)消化批。 2. 2毒種221名稱(chēng)及來(lái)源生產(chǎn)用毒種為甲型肝炎病毒TZ84株、呂8株或其他批準(zhǔn)的人二倍體細(xì)胞適應(yīng)的甲型肝炎病毒株。222種子批的建立應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。甲型

3、肝炎病毒TZ84株原始種子批不超過(guò)第20代，主種子批為第22代，工作種子批為第23代， 生產(chǎn)的疫苗代次應(yīng)不超過(guò)第24代。呂8株原始種子批應(yīng)不超過(guò)第24代，主種子批不超過(guò)第25代，工作種子批不超過(guò)第30代，生產(chǎn)的疫苗病毒代次應(yīng)不超過(guò)第31代。223種子批的檢定主種子批應(yīng)進(jìn)行以下全面檢定，工作種子批進(jìn)行2.2.3.12.2.3.4項(xiàng)檢定。2231鑒別試驗(yàn)用甲肝病毒特異高效價(jià)免疫血清（非人源）和甲肝抗體陰性血清分別與5001000CCID50/ml甲肝病毒等量混合，置37水浴60分鐘，接種人二倍體細(xì)胞2BS株或KMB17株，置35培養(yǎng)至病毒增殖高峰期， 提取培養(yǎng)物后用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，經(jīng)中和的培養(yǎng)物檢

4、測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性， 未經(jīng)中和的病毒液檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。2232病毒滴定取毒種做10倍系列稀釋?zhuān)?取至少3個(gè)稀釋度， 分別接種人二倍體細(xì)胞，置35培養(yǎng)至病毒增殖高峰期,收獲后提取甲型肝炎病毒，用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行病毒滴定， 病毒滴度應(yīng)不低于6.50lgCCID50/ml。 2233無(wú)菌檢查 依法檢查（附錄X A），應(yīng)符合規(guī)定。 2234支原體檢查依法檢查（附錄X B），應(yīng)符合規(guī)定。2235病毒外源因子檢查依法檢查（附錄X C），應(yīng)符合規(guī)定。供試品可不經(jīng)甲型肝炎病毒免疫特異性血清中和，直接接種小鼠觀察。2236 免疫原性檢查用主種子批毒種制備原疫苗， 將疫苗4倍系列稀釋至少三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種18

5、-22g ICR 小鼠10只，每只腹腔接種1.0ml。接種4-5周后采血，用ELISA 方法檢測(cè)甲肝抗體，計(jì)算ED50， 應(yīng)符合規(guī)定。224 毒種保存毒種應(yīng)于-60以下保存。23 原液231細(xì)胞制備同2.1.2項(xiàng)。232培養(yǎng)液培養(yǎng)液為含適宜濃度新生牛血清的MEM或Eagles液。新生牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合要求（附錄XIII D）， 且甲肝抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性。233對(duì)照細(xì)胞外源因子檢查依法檢查（附錄X C），應(yīng)符合規(guī)定。234病毒接種和培養(yǎng)取工作種子批毒種按適宜的MOI接種于人二倍體細(xì)胞（同一工作種子批應(yīng)按同一MOI接種）。于適宜溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)期間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換維持液，維持液為含適宜濃度新生牛血

6、清的MEM或Eagles液。 235病毒收獲培養(yǎng)至病毒增殖高峰期后，采用適宜濃度的胰蛋白酶或其他適宜方法消化含甲肝病毒的細(xì)胞，經(jīng)離心或過(guò)濾的方法收集后為病毒收獲物。236病毒收獲物檢定按31項(xiàng)進(jìn)行237病毒提取檢定合格的病毒收獲物經(jīng)凍融和（或）超聲波或其他適宜方法處理收獲病毒后，用三氯甲烷抽提以提取甲肝病毒。 2.3.8 合并同一細(xì)胞批生產(chǎn)的病毒收獲物經(jīng)提取病毒后可進(jìn)行合并。2.3.9 病毒純化采用柱色譜法或其他適宜的方法進(jìn)行純化。 純化前或純化后超濾濃縮至確定蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)， 純化后取樣進(jìn)行抗原含量測(cè)定。 239病毒滅活將純化后甲肝病毒液除菌過(guò)濾后，加入終濃度為250ug/ml的甲醛， 于

7、36.5±0.5滅活12天，病毒滅活到期后，每個(gè)滅活容器應(yīng)立即取樣， 分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)。滅活后的病毒液即為原液2.3.10 原液保存于2-8保存。2311原液檢定按32項(xiàng)進(jìn)行。24半成品241配制病毒原液經(jīng)鋁吸附后， 按規(guī)定的抗原量進(jìn)行稀釋?zhuān)杉尤脒m宜濃度的2-苯氧乙醇作為防腐劑，即為半成品。 242半成品檢定按33項(xiàng)進(jìn)行。25成品25.1分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。252分裝應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.5.3 規(guī)格每支0.5ml或1.0ml， 每1次成人用劑量為0.5ml或1.0ml， 含甲肝病毒抗原含量按批準(zhǔn)的執(zhí)行。254包裝應(yīng)符合 “生物制品包裝規(guī)

8、程”規(guī)定。 3.檢定31病毒收獲物檢定3.1.1 無(wú)菌檢查依法檢查（附錄X A），應(yīng)符合規(guī)定。3.1.2支原體檢查依法檢查（附錄X B），應(yīng)符合規(guī)定。313抗原含量采用ELISA法測(cè)定， 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)按批準(zhǔn)的執(zhí)行。314 蛋白質(zhì)含量采用附錄VI B第二法測(cè)定， 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)按批準(zhǔn)的執(zhí)行3.2 原液檢定321無(wú)菌檢查依法檢查（附錄X A），應(yīng)符合規(guī)定。3.2.2抗原含量采用ELISA法測(cè)定， 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)按批準(zhǔn)的執(zhí)行。3.2.3蛋白質(zhì)含量采用附錄VI B第二法測(cè)定， 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)按批準(zhǔn)的執(zhí)行。3.2.4 病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)取病毒滅活后供試品， 將病毒滅活液接種人二倍體細(xì)胞，置33-35培養(yǎng)適宜時(shí)間（TZ84株不少于21天

9、， 呂8株不少于12天)收獲，同法盲傳2代，用ELISA方法檢測(cè)甲肝病毒，應(yīng)為陰性。同時(shí)設(shè)病毒陽(yáng)性對(duì)照， 病毒滴度應(yīng)不低于6.50 lgCCID50/ml。3.2.5牛血清白蛋白殘留量用ELISA方法進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)不高于100ng/ml。3.2.6去氧膽酸鈉殘留量采用去氧膽酸鈉作為細(xì)胞裂解劑的，應(yīng)按本標(biāo)準(zhǔn)附錄1 進(jìn)行該項(xiàng)檢定測(cè)，殘留量應(yīng)不高于20g/ml。3.2.7聚山梨酯80殘留量生產(chǎn)過(guò)程中使用聚山梨酯80的，殘留量應(yīng)不高于20g/ml（附錄VI H）。33半成品檢定 331無(wú)菌檢查依法檢查（附錄X A），應(yīng)為符合規(guī)定。 332 pH值測(cè)定應(yīng)為5.57.0（附錄 V A）。323氫氧化鋁吸附效

10、果測(cè)定取吸附后上清液，用ELISA方法檢測(cè)甲肝抗原含量，上清液中甲肝抗原應(yīng)小于吸附總量的5%。3.3.4 鋁含量測(cè)定應(yīng)不高于1.20mg/ml（附錄VII F）。335聚乙二醇6000殘留量應(yīng)小于10g/ml（附錄VI G）。34成品檢定 341鑒別試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫方法檢查，應(yīng)證明含有甲型肝炎病毒抗原。3.4.2 外觀應(yīng)為微乳白色混懸液體，可因沉淀而分層，易搖散，不應(yīng)有搖不散的塊狀物， 無(wú)異物。343裝量按附錄I A 裝量項(xiàng)下進(jìn)行， 應(yīng)不低于標(biāo)示量。 344 pH值應(yīng)為5.57.0（附錄 V A）。 345鋁含量應(yīng)不高于1.20mg/ml（附錄VII F）。 346游離甲醛含量應(yīng)不高于50g/

11、ml（附錄VI L）。347 三氯甲烷殘留量應(yīng)不高于0.006（附錄VI V）3.4.8 2-苯氧乙醇含量采用2-苯氧乙醇作為防腐劑的進(jìn)行該項(xiàng)檢測(cè)， 按本標(biāo)準(zhǔn)附錄2 進(jìn)行檢測(cè)， 應(yīng)為4.0-6.0mg/ml。349無(wú)菌檢查依法檢查（附錄X A），應(yīng)符合規(guī)定。 3410細(xì)菌內(nèi)毒素檢查應(yīng)不高于10EU/ml（附錄XII E凝膠限量試驗(yàn)）。3411異常毒性檢查依法檢查（附錄X F），應(yīng)符合規(guī)定。3412 體外相對(duì)效力測(cè)定應(yīng)不低于0.75附錄（附錄X S） 3.4.13 抗生素殘留量生產(chǎn)過(guò)程中加入抗生素的應(yīng)進(jìn)行該項(xiàng)檢查。 采用酶聯(lián)免疫法，應(yīng)不高于10ng/ml 4保存、運(yùn)輸及有效期28避光保存。自生產(chǎn)

12、之日起， 按批準(zhǔn)有效期執(zhí)行。5. 說(shuō)明書(shū)6. 附錄附錄1 去氧膽酸鈉殘留量測(cè)定法附錄2 2-苯氧乙醇含量測(cè)定附錄1去氧膽酸鈉殘留量測(cè)定法本法系將供試品與去氧膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液置酸性條件下，于387nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，采用對(duì)照品法計(jì)算供試品中去氧膽酸鈉的殘留量。1.試劑（1） 去氧膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（100g/ml） 精密稱(chēng)取干燥恒重的去氧膽酸鈉0.0 5g于燒杯內(nèi)，加入冰乙酸30ml使溶解，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶?jī)?nèi)，用適量水沖洗燒杯洗液轉(zhuǎn)入容量瓶，再補(bǔ)加水至50ml。使用時(shí)10倍稀釋即為100g/ml。（2） 60% 乙酸溶液 取冰乙酸150ml,加水100ml，混勻。（3）43.5% 硫酸溶液量取濃硫酸

13、453ml，緩慢加入500ml水中，邊加邊攪拌，補(bǔ)水至1000ml。2. 測(cè)定方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密吸取去氧膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（100g/ml）0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.8ml, 于50ml比色管中， 各加60% 乙酸溶液至1.0ml，使去氧膽酸鈉濃度分別為0g/ml，10g/ml，20g/ml, 40g/ml, 80g/ml, 各加43.5% 硫酸溶液14.0ml，搖勻，70 加熱20分鐘，冷卻，于387nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。（2）供試品制備：取供試品1.0ml于50ml比色管中，加43.5% 硫酸溶液14.0ml，搖勻，70 加熱20分鐘，冷卻，于387nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以去氧膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)其相應(yīng)的吸光度作直線回歸，將供試品溶液的吸光度代入回歸方程，計(jì)算供試品中去氧膽酸鈉含量。附錄22-苯氧乙醇含量測(cè)定采用高效液相色譜法進(jìn)行2-苯氧乙醇含量測(cè)定。1. 試驗(yàn)設(shè)備高效液相色譜：BBK089， UV-270nm檢測(cè)色譜柱：micro Bondapack C18 10um流動(dòng)相：乙腈（CH3CN-H2O） 50/50 v/v 流速：1ml/min 上樣量：10ul2. 測(cè)定