微生物發(fā)酵工程案例教學ppt課件

1、Engineered Saccharomyces cerevisiae Engineered Saccharomyces cerevisiae that produces 1,3-propanediol from D-that produces 1,3-propanediol from D-glucoseglucose工程化啤酒酵母細胞利用工程化啤酒酵母細胞利用D-D-葡萄糖生產(chǎn)葡萄糖生產(chǎn)1,3-1,3-丙二醇丙二醇 文獻查找：張帆文獻查找：張帆 文獻翻譯：曾熙、朱悅、文獻翻譯：曾熙、朱悅、張帆張帆 PPT PPT整理及展示：張艷麗整理及展示：張艷麗組長）組長） 二、背景二、背景三、實驗方法三

2、、實驗方法一、摘要一、摘要四、實驗結(jié)果四、實驗結(jié)果摘要摘要在發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中啤酒酵母是一種安全的微生物。1,3-丙二醇是一種廣泛用于聚合物生產(chǎn)的重要化學原料，但是由于化學合成成本昂貴，它的實用性受到限制。本研究的目的就是利用工程化啤酒酵母低成本生產(chǎn)1,3-丙二醇。啤酒酵母利用D-葡萄糖作為原料，能夠生產(chǎn)丙三醇，而不是1.3-丙二醇。在本研究中，我們克隆了兩個基因yqhD和dahB，這兩個基因可以使丙三醇轉(zhuǎn)化成1,3-丙二醇，把這兩個基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化實驗整合到啤酒酵母的W303-1A染色體上。這個工程化的啤酒酵母通過功能性yqhD和dhaB基因來實現(xiàn)D-葡萄糖到1,3-丙二醇的生產(chǎn)。據(jù)了解，該研究在

3、1,3-丙二醇生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)中是一種安全的、低成本的方法。背景背景背景背景使用與成本的矛盾化學合成發(fā)酵背景背景 克雷伯肺炎菌：在克雷伯肺炎菌中，參與1,3-丙二醇的生物合成的基因是dhaB和dhaT。DhaB是一種依賴維生素B12的脫水酶，它轉(zhuǎn)化丙三醇到3-羥基丙醛，而DhaT是一種依賴NADH的氧化還原酶，它可以轉(zhuǎn)化3-羥基丙醛到1,3-丙二醇。 大腸桿菌：大腸桿菌能利用D-葡萄糖生產(chǎn)丙三醇，可以通過把dhaB和dhaT基因整合到大腸桿菌來生產(chǎn)1,3-丙二醇，但是DhaT活性過低，導致收率低。yqhD基因的發(fā)現(xiàn)解決了這一問題。背景背景 克雷伯肺炎菌的生產(chǎn)原料是丙三醇，價格昂貴。 大腸桿菌產(chǎn)生內(nèi)毒素

4、，可能引起疾病。 啤酒酵母已經(jīng)用于發(fā)酵產(chǎn)業(yè)好多年了，主要是由于它使用D-葡萄糖這種低成本原料作為碳源和能源。 野生型啤酒酵母只產(chǎn)生丙三醇，但沒有產(chǎn)生1,3-丙二醇的能力。背景背景實驗方法實驗方法一、資料：一、資料：PCRPCR試劑、限制酶、小牛堿性磷酸酶、試劑、限制酶、小牛堿性磷酸酶、凝膠提取盒、尼龍膜等凝膠提取盒、尼龍膜等二、培養(yǎng)基和生長條件二、培養(yǎng)基和生長條件實驗方法實驗方法四種培養(yǎng)基：發(fā)酵條件：有氧環(huán)境、搖床250rev/min30。LB培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基B培養(yǎng)基CM培養(yǎng)基實驗方法實驗方法用于這項研究的菌株、質(zhì)粒和引物：實驗方法實驗方法 DNA片段的PCR擴增 分別構(gòu)建包含yqhD基因的

5、pZR1質(zhì)粒和dahB基因的pZR2質(zhì)粒 分別構(gòu)建包含yqhD基因的pZR1質(zhì)粒和dahB基因的pZR2質(zhì)粒 土壤農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化 啤酒酵母染色體上的yqhD和dhaB基因的PCR與印跡雜交分析 氣相色譜法測定1,3-丙二醇實驗方法實驗方法 分別構(gòu)建包含yqhD基因的pZR1質(zhì)粒和dahB基因的pZR2質(zhì)粒；構(gòu)建pZR3質(zhì)粒；構(gòu)建包含yqhD和dhaB基因的質(zhì)粒pZR4實驗方法實驗方法土壤農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化在本研究通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法將在本研究通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法將yqhD基因和基因和dhaB基因整合到啤酒酵母的染色體上?；蛘系狡【平湍傅娜旧w上。第一步，質(zhì)粒第一

6、步，質(zhì)粒pZR4通過電穿孔轉(zhuǎn)染到農(nóng)桿菌通過電穿孔轉(zhuǎn)染到農(nóng)桿菌LBA4404，形成，形成LBA4404-ZR4.農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌LBA4404-ZR4在含有博來霉素的在含有博來霉素的B培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，收菌，培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，收菌，在在B培養(yǎng)基上重懸培養(yǎng)含或不含培養(yǎng)基上重懸培養(yǎng)含或不含100umol/l乙酰丁乙酰丁香酮），生長到香酮），生長到1x1011cell ml-1，再孵化培養(yǎng)，再孵化培養(yǎng)6h。與此同時，啤酒酵母與此同時，啤酒酵母W303-1在搖床在搖床30下培養(yǎng)過下培養(yǎng)過夜，稀釋夜，稀釋20倍到新鮮的倍到新鮮的YPD培養(yǎng)基上，培養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6h。細。細胞通過離心收集，用不含乙酰丁香酮的胞

7、通過離心收集，用不含乙酰丁香酮的B培養(yǎng)基清培養(yǎng)基清洗，然后重懸，接種到相同培養(yǎng)基上，最后生長到洗，然后重懸，接種到相同培養(yǎng)基上，最后生長到1x109cells ml-1.隨后，隨后，50ul啤酒酵母啤酒酵母W303-1A和和50ul農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌LBA4404-ZR4做好前期混合準備，儲存在高壓蒸汽做好前期混合準備，儲存在高壓蒸汽過的膠膜紙上直徑過的膠膜紙上直徑25mm），上面有固體），上面有固體CM培養(yǎng)培養(yǎng)基，添加乙酰丁香酮，孵育在基，添加乙酰丁香酮，孵育在28，72h。然后，。然后，膠膜紙被移到固體膠膜紙被移到固體YPD培養(yǎng)基含培養(yǎng)基含150ug/ml博來霉博來霉素），孵育素），孵育30，3

8、-4days。為了預防供體農(nóng)桿菌。為了預防供體農(nóng)桿菌過生長，在培養(yǎng)基中添加了過生長，在培養(yǎng)基中添加了200ug/ml頭孢噻肟。啤頭孢噻肟。啤酒酵母指定的酒酵母指定的W303-1A-ZR，在，在30，YEPD含含150ug/ml博來霉素培養(yǎng)基中進一步純化。博來霉素培養(yǎng)基中進一步純化。實驗方法實驗方法 啤酒酵母染色體上的yqhD和dhaB基因的PCR與印跡雜交分析：實驗方法實驗方法酶試驗酶試驗細胞粗提物通過細胞糊狀物聲波破碎和離心獲得，細胞粗提物通過細胞糊狀物聲波破碎和離心獲得，細胞粗提物含各種酶。細胞粗提物含各種酶。丙三醇脫水酶活性通過使用丙三醇脫水酶活性通過使用3-3-甲基甲基-2-2-苯并噻

9、唑方苯并噻唑方法評估。法評估。由于由于3-3-羥基丙醛的不穩(wěn)定性，羥基丙醛的不穩(wěn)定性，1,3-1,3-丙二醇氧化還原丙二醇氧化還原同工酶活性通過逆反應同工酶活性通過逆反應1,3-1,3-丙二醇轉(zhuǎn)化到丙二醇轉(zhuǎn)化到3-3-羥羥基丙醛來斷定。基丙醛來斷定。1,3-1,3-丙二醇同工酶的濃度通過丙二醇同工酶的濃度通過GerlindGerlind方法斷定。方法斷定。所有酶試驗在所有酶試驗在3030度中進行。度中進行。一個酶活單位定義成：一個酶活單位定義成：3030度下，催化度下，催化1umol1umol底物到底物到產(chǎn)物所需的酶數(shù)量。特殊的酶活力顯示的單位產(chǎn)物所需的酶數(shù)量。特殊的酶活力顯示的單位/mg/m

10、g蛋白。所有酶試驗重復兩次，報道的數(shù)值是兩次蛋白。所有酶試驗重復兩次，報道的數(shù)值是兩次實驗的均值。細胞提取物中的蛋白濃度是通過實驗的均值。細胞提取物中的蛋白濃度是通過BradfordBradford法斷定的。法斷定的。實驗方法實驗方法氣相色譜法測定氣相色譜法測定1,3-1,3-丙二醇：丙二醇：1,3-1,3-丙二醇和丙三醇是通過氣相色譜法測定的。本丙二醇和丙三醇是通過氣相色譜法測定的。本研究使用的圓柱體是研究使用的圓柱體是2m X 5mm2m X 5mm不銹鋼圓柱體，包裝不銹鋼圓柱體，包裝的色譜載體是的色譜載體是101.101.氮氣，流速氮氣，流速40 ml min-1.40 ml min-1.檢測溫檢測溫度定在度定在220220，圓柱體溫度定在，圓柱體溫度定在210210。實驗結(jié)果實驗結(jié)果 工程化啤酒酵母關(guān)鍵質(zhì)粒的構(gòu)建 基因yqhD和dhaB整合到啤酒酵