多藥耐藥基因的臨床意義與檢測(cè)方法

1、腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的多藥耐受性(MDRi)是癌癥治療的主要障礙之一。所謂多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是由一種藥物誘發(fā)而同時(shí)對(duì)其它多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的 抗癌藥物產(chǎn)生的交叉耐藥，既對(duì)廣泛的結(jié)構(gòu)和功能不相同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生的耐藥，導(dǎo)致某些聯(lián)合化療方案失敗。盡管各種新的化療藥物和治療方案不斷地產(chǎn)生及應(yīng)用，并在某些惡性腫瘤的治療上取得成功，但在大多數(shù)最常見(jiàn)的惡性腫瘤中卻收獲不大。臨床上許多腫瘤在經(jīng)歷了最初有效的化療后，又再?gòu)?fù)發(fā)，多發(fā)癌化療者效果差其主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的耐 受性。腫瘤耐藥原因很多，目前公認(rèn)最主要是多藥耐藥基因的過(guò)渡表達(dá)，克服此障礙，腫瘤化療將取

2、得決定性突破。1 MDR勺概念腫瘤細(xì)胞耐藥性可分為內(nèi)在性耐藥(i ntri nsic drug resista nee)和獲得性耐藥(acquired drug resista nee)兩類(lèi)，既原發(fā)地存在于某些腫瘤中，稱(chēng)內(nèi)在性 耐藥；繼發(fā)于化療后，稱(chēng)獲得性耐藥。根據(jù)耐藥譜可分為原藥耐藥(primary drug resistance,PDR)和多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)。PDR只對(duì)誘導(dǎo)的原藥產(chǎn)生耐藥，而對(duì)其它藥物不 產(chǎn)生交叉耐藥。而MDR!種藥物誘發(fā)，而同時(shí)對(duì)其它多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全 不同的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥。內(nèi)在性耐藥的原因仍不清楚，而獲得性耐藥是由 于

3、變異的耐藥腫瘤細(xì)胞亞群過(guò)渡生長(zhǎng)所致。內(nèi)在性耐藥與獲得性耐藥作為一種獨(dú)特的耐藥現(xiàn)象是成功地治療腫瘤的關(guān)鍵性難題，因而成為近幾年國(guó)內(nèi)外研究和探 索的熱點(diǎn)。2 MDF的耐藥機(jī)制1970年Biedler和Riehm首先描述了 MDR6型：一種藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥細(xì)胞株可用對(duì)其它多種化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能完全不同的化療藥物產(chǎn)生耐藥。他們發(fā)現(xiàn)對(duì)放線菌D耐藥的細(xì)胞，同時(shí)也對(duì)多種抗腫瘤抗生素如柔紅霉素等，以及結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制迥異的植物堿類(lèi)抗腫瘤藥如長(zhǎng)春新堿等交叉耐藥。1976年, Julia no等最先在耐藥的中國(guó)蒼鼠卵巢細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種新的與耐藥程度呈數(shù)量關(guān)系的高分 子量的細(xì)胞膜糖蛋白，命名為 P糖蛋白(p-glycop

4、ratain,p-gp)。因其分子量為 170kda，又名pgp170,認(rèn)為此蛋白可降低細(xì)胞膜對(duì)藥物的通透性而引起耐藥。 后來(lái)又陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在不同來(lái)源的多藥耐藥細(xì)胞中這種P糖蛋白的分子量范圍在130180kda,主要集中在150180kda,它由多藥耐藥基因 MDR編碼。近十幾 年，國(guó)外已從耐藥腫瘤細(xì)胞株中分離出耐藥基因MDf和它的表達(dá)P糖蛋白。1986年chen等克隆了編碼P糖蛋白的cDnAH2.1 MDF基因家族在哺乳動(dòng)物，MDF基因是一較小的相對(duì)保守的基因家族。在人類(lèi)基因組中， 它含有兩個(gè)基因 MD1和MDR在嚙齒類(lèi)由三個(gè)基因組成： MDR MDR MDR 22 MDRS 因基因圖譜的研

5、究表明人類(lèi) MDF兩種基因定位于第7號(hào)染色體的q21.1帶的 330kb中。含有28個(gè)外顯子，28個(gè)外顯子序列與 cDNA完全一致，cDNA全長(zhǎng)4.5kb。 在不同的細(xì)胞系中MD1啟動(dòng)子顯示的活性不同，其增加子的活性亦不同，因此 MD1表達(dá)呈組織特異性。2.3 MDRS因表型MDRS因表型是與其基因產(chǎn)物 P糖蛋白有關(guān)的。許多研究表明，MDR表型表 現(xiàn)為MDF基因的過(guò)度表達(dá)伴有或不伴有基因擴(kuò)增。 研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥程度低的耐 藥細(xì)胞系，可無(wú)MDF基因擴(kuò)增，只有MDF基因的表達(dá)增加（即mRNA勺表達(dá)增加， P糖蛋白的功能增強(qiáng)）。此時(shí)低度耐藥細(xì)胞P糖蛋白的功能的增加是由于 mRNA專(zhuān) 錄水平增高，而非

6、基因拷貝增加所致。MDR6型最突出的特點(diǎn)是其編碼P糖蛋白功能增加而導(dǎo)致產(chǎn)生了多藥耐藥 性。因此P糖蛋白是MDRS因的表型標(biāo)志。2.4 P糖蛋白MDRS因編碼的P糖蛋白是分子量約為170Kda的胞膜蛋白，由1280個(gè)氨基酸 組成，同源雙鏈，每條鏈有6個(gè)跨膜疏水區(qū)，其構(gòu)成三個(gè)跨膜孔有一個(gè)細(xì)胞內(nèi)核 苷糖連接點(diǎn)可能與ATP連接并發(fā)生水解作用。通常認(rèn)為，P糖蛋白具有一種能量 依耐的跨膜藥物外輸泵功能，當(dāng)腫瘤細(xì)胞與抗癌藥物接觸時(shí)，脂溶性藥物濃度梯 度進(jìn)入細(xì)胞，而P糖蛋白則結(jié)合藥物分子，同時(shí)其 ATP結(jié)合位點(diǎn)連上ATP ATP 水解后釋放能量將藥物從胞內(nèi)泵出胞外， 藥物在胞內(nèi)濃度不斷下降，其細(xì)胞毒作 用因而

7、減弱甚至喪失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。人類(lèi)MD1和MD2兩種基因分別編碼了兩種結(jié)構(gòu)相似，功能不同的 P糖蛋白， MD1和MD2兩種基因及其所編碼的兩種 P糖蛋白具有高度同源性，其同源性達(dá) 80%然而這兩種基因產(chǎn)物的表達(dá)卻呈組織特異性而且有不同的生理功能。MDR的表達(dá)產(chǎn)物可將親脂類(lèi)化療藥泵出細(xì)胞外，因而有耐藥特性；MDR勺表達(dá)產(chǎn)物則主要分布在骨骼肌纖維上，可將肌纖維的代謝產(chǎn)物，如激素等轉(zhuǎn)運(yùn)到膜外，無(wú)轉(zhuǎn) 運(yùn)親脂類(lèi)藥物功能，故不具多藥耐藥性的作用。然而在最近的研究報(bào)告中這種基 因仍然作為一個(gè)重要提示，即治療前的髓性白血病 B細(xì)胞出現(xiàn)高表達(dá) 。3 在正常組織及腫瘤組織中 MDR基因表達(dá)3.1 在正常組織中MD1

8、基因表達(dá)認(rèn)識(shí)P糖蛋白在體內(nèi)正常表達(dá)的進(jìn)行和功能是重要的。P糖蛋白在正常人體細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)，表明MDF基因并非異?；颍琍糖蛋白并非是一種異常蛋白， 而且具有一定的生理功能。了解MDF基因在正常組織中表達(dá)，具有三個(gè)作用。（1） 為了建立一個(gè)腫瘤中MD1表達(dá)增加的基線。（2）增加我們關(guān)于正常P-gp生理功能 知識(shí)。（3）更好的了解在緩解人類(lèi)腫瘤耐藥方面的潛在作用。正常組織中分為高、中、低三個(gè)表達(dá)水平。腎上腺、腎臟高水平表達(dá)；肺、肝、結(jié)腸、空腸、直腸中 等表達(dá)；而皮膚、骨骼肌、心肌、脾、食道、胃、卵巢、骨髓等則低表達(dá)或不表 達(dá)?？梢园l(fā)現(xiàn)MD1表達(dá)主要是在具有分泌和排泄功能的器官組織特殊上皮細(xì)胞 中，

9、其功能為降低有害的外源性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害，具有正常的生理保護(hù)功能。 維持血腦、血睪丸及血胎盤(pán)屏障（腦組織及睪丸組織血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤(pán)滋養(yǎng)葉 細(xì)胞MD1基因表達(dá)水平高）。已有報(bào)道MDF基因及其產(chǎn)物在正常細(xì)胞的防御中起 著不可忽略的作用，尤其是對(duì)化學(xué)致癌物及化學(xué)毒素的防御：1, 7,幻。3.2 在實(shí)體腫瘤中MD1基因表達(dá)如前所述，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性分為內(nèi)在性耐藥與獲得性耐藥兩類(lèi)。在腫瘤細(xì)胞中，MD啲表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的組織起源有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體腫瘤中 MD1基因表達(dá)分四組：第一組癌癥通常表達(dá)高水平的 MD麗RN A大多數(shù)本組腫瘤 正常組織中存在中間至高水平的 P-gp 170表達(dá)，如腎細(xì)胞癌、

10、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞 癌、腎上腺皮質(zhì)癌、嗜絡(luò)細(xì)胞瘤等。臨床發(fā)現(xiàn)這些腫瘤顯示出對(duì)治療的不敏感性 （那就是說(shuō)存在內(nèi)在性耐藥）。第二組所包括的癌癥偶然表達(dá)高水平的 MDimRNA中間MD1表達(dá)水平）、如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、乳腺癌，本組腫 瘤趨向比第一組治療效果好，不幸的是本組經(jīng)過(guò)化療后常常得到獲得性耐藥。 第 三組所包括的腫瘤罕見(jiàn) MDimRN表達(dá)（幾乎所有的都沒(méi)檢測(cè)到或低 MD1表達(dá)）如 卵巢癌、食道癌、wilm's瘤、膀胱癌、肺癌等。本組腫瘤通常化療治療是有效 的，但許多腫瘤通過(guò)藥物刺激將發(fā)展為獲得性耐藥。第四組包括腫瘤經(jīng)過(guò)化療后 MD1基因表達(dá)水平提高。3.3 在惡性血液學(xué)方面檢測(cè) M

11、D1基因表達(dá)許多血液失調(diào)的病人在治療過(guò)程中發(fā)展成為耐藥。由此MDR既念產(chǎn)生。研究白血病病人耐藥的最大優(yōu)勢(shì)是不論治療前與治療后都很容易獲得腫瘤標(biāo)本，且不受腫瘤大小、存在部位和血管血流等非耐藥因素的影響。 因此與實(shí)體腫瘤相比惡 性血液病人MD1表達(dá)的數(shù)據(jù)是回歸性的且經(jīng)過(guò)了化療治療。在正常血液細(xì)胞內(nèi)(全骨髓、脾、純凈的淋巴細(xì)胞)發(fā)現(xiàn)低和非常低MD1水平 表達(dá)。在幾乎所有類(lèi)型白血病、多發(fā)性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤不論治療或未 經(jīng)治療病人都有MD1水平增高的報(bào)道，MD1水平可以在一個(gè)由低到高范圍甚至在 未治療病人中出現(xiàn)高水平表達(dá)。我們用非同位素原位雜交方法檢測(cè)正常人骨髓 MDimRNA表達(dá)陽(yáng)性率低于10

12、%強(qiáng)度為弱陽(yáng)性。惡性血液病在MD1表達(dá)方面可以分為三個(gè)不同組。第一組MD1水平通常在未 治療前增高即內(nèi)在性耐藥腫瘤，如CML在其復(fù)發(fā)期。第二組為未經(jīng)治療的癌癥病 人MDF水平偶爾提高，如成人急性淋巴性白血病(ALL)、成人急性非淋巴細(xì)胞白 血病(ANLL)、何杰金氏淋巴瘤。第三組，在有些癌癥中經(jīng)治療復(fù)發(fā)時(shí)，MD1水平提高，包括 ALL、ANLL在臨床急性白血病研究中發(fā)現(xiàn)，MDimRNAB性組的緩解率(CR)，明顯低于 MDimRNA性組的CR并且MDimRNAB性患者達(dá)到緩解而需療程較 MD1陰性患 者長(zhǎng)。有文獻(xiàn)報(bào)道MD1基因表達(dá)陽(yáng)性的初治患者 CR率為27%-60%，而MD1基 因表達(dá)陰性者

13、CR率為72%-90%說(shuō)明MDFS因表達(dá)是導(dǎo)致誘導(dǎo)緩解失敗的主要 原因。4 MDt基因表達(dá)研究的臨床意義研究MD1基因表達(dá)與臨床化療的關(guān)系，是從分子水平而非細(xì)胞水平來(lái)探討腫 瘤對(duì)化療藥物的敏感性與耐受性，可用來(lái)預(yù)測(cè)病人對(duì)化療的反應(yīng)以及化療過(guò)程中 療效的判斷和監(jiān)測(cè)預(yù)后，可望使腫瘤在更高水平上進(jìn)行治療和觀察，使化療個(gè)體 化，臨床醫(yī)生可根據(jù)每個(gè)病人MDR勺表達(dá)水平判斷耐藥程度，合理地制定化療方 案，具體來(lái)講：2： (1)預(yù)測(cè)病人對(duì)化療藥物的敏感性與耐受性，有針對(duì)性地選擇 最有效的藥物，避免盲目用藥，減少不必要的毒副作用。(2)化療過(guò)程中，若MDR 表達(dá)逐漸增高，要注意獲得性多藥耐藥性的發(fā)生，及時(shí)調(diào)整

14、化療方案。(3)在未進(jìn)行化療前，MD1即顯高表達(dá)，表示存在內(nèi)在性多藥耐藥性，可考慮使用MDR逆 轉(zhuǎn)劑配合抗癌藥物化療。 預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。(5)在研究中評(píng)價(jià)MDR 逆轉(zhuǎn)藥物的療效。與MD1基因相關(guān)的化療藥物包括 烷化劑類(lèi)。 植物堿類(lèi)抗腫瘤藥。(3) 抗腫瘤抗生素類(lèi)。(4)激素類(lèi)等。通常為分子量大的親脂類(lèi)化合物。與 MD1基因 無(wú)關(guān)的化療藥物包括(1)抗代謝類(lèi)藥物，如5-氟脲嘧啶等。(2)鉑類(lèi)化合物如順鉑 等2 5 由于MDF相目關(guān)的化療藥物包括了常用抗癌藥絕大部分，可供MDF高表達(dá)病人選擇使用的抗癌藥所剩無(wú)幾。如何克服 ？目前研究方向之一是選擇逆轉(zhuǎn)劑。所謂 逆轉(zhuǎn)劑機(jī)理是，逆轉(zhuǎn)劑能與耐藥

15、細(xì)胞表面的P糖蛋白結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制P糖蛋白 與化療藥物結(jié)合，阻止化療藥物從細(xì)胞內(nèi)流出，從而提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度， 增強(qiáng)化療效果。(圖1B)目前發(fā)現(xiàn)的可逆轉(zhuǎn)MDF的藥物包括(1)鈣通道阻滯劑；如 異博定。 鈣調(diào)蛋白拮抗劑：如環(huán)胞菌素 A等。(3)抗心律失常藥：如潘生丁， 心得安等。目前主要用于臨床的是異博定(VRP)和環(huán)胞霉素A(CSA)，但都存在一 定毒副作用。如果還存在其它耐藥機(jī)制則影響逆轉(zhuǎn)效果。5 MDF的檢測(cè)方法隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，檢測(cè)手段不斷增加。目前主要從分子水平、蛋白水 平、細(xì)胞水平多途徑展開(kāi)了研究。5.1 分子水平 由于人腫瘤細(xì)胞幾乎不存在 MDFDNAT增，因此，無(wú)法檢測(cè)D

16、NA 變化，主要是檢測(cè)MDFmRN的表達(dá)水平。常用的方法包括：RT-PCR原位雜交 (ISH)、Slot-blot(SB) 、Northern blot(NB) 、RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)等：。5.2 蛋白水平 免疫組織化學(xué)法(IHC)，免疫熒光等。常用的P-gp特異性單克 隆抗體有JSB-1、MRK1 C219 U12、HYB-612等，不同的單抗識(shí)別不同的抗原決 定簇，每種單抗特異性和親合力不完全相同。5.3 細(xì)胞水平 檢測(cè)細(xì)胞的藥物輸出功能，采用熒光染料如若丹明 -123或具有 天然熒光的柔紅霉素與細(xì)胞共同培養(yǎng)后，用熒光分光度計(jì)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞內(nèi)藥物濃 度，與對(duì)照組比較判定細(xì)胞的耐藥程度。 最近國(guó)

17、外使用流式細(xì)胞儀，高分析技術(shù) (掃描激光和聚焦顯微鏡)等先進(jìn)設(shè)備對(duì)P-gp進(jìn)行功能檢測(cè)。Piwneca-Worns等 描述一個(gè)人造r散射的锝洛合物hexakis 99MTC SESTAMIB對(duì)P-gp170進(jìn)行功能 圖象分析。99MTC SESTAMIB是一脂性具有放射性的藥物性陽(yáng)離子其可被多藥轉(zhuǎn)移機(jī)制主動(dòng)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這項(xiàng)技術(shù)通過(guò)有價(jià)值的r散射性的99MTG進(jìn)行P-gp170功能測(cè)試，是一個(gè)新穎的快速測(cè)定人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞P-gp170表達(dá)的方法。以上各種方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)。綜合評(píng)價(jià)： 敏感性，PCR>ISH>PGP>SBNB及細(xì)胞功能測(cè)定。特異性，PCR ISH>PGP>S

18、BNB及細(xì)胞功能測(cè)定:2,3目前MD1基因檢測(cè)強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)的重要性。要求標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)為：既要有足夠的 靈敏性以檢測(cè)小體積樣本中 MDFS因表達(dá)，并且能定量且能區(qū)別出正常組織表達(dá) 還是腫瘤組織表達(dá)。要想達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)，幾種實(shí)驗(yàn)組合會(huì)給臨床提供更確切的信息。 且參與的實(shí)驗(yàn)室須規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告及進(jìn)行質(zhì)量控制：1, 70由于上面介紹這些檢測(cè)技術(shù)不論是在靈敏性方面還是特異性方面都不可避 免地受到一因素的限制。這些因素導(dǎo)致我們不論是對(duì)正常組織還是惡性腫瘤組織 MDR方面的檢測(cè)都出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果。當(dāng)然抗腫瘤藥物耐藥過(guò)程的復(fù)雜性，及 一些外在其它因素如腫瘤組織的變異，其它耐藥機(jī)制存在和低水平的MDR標(biāo)志表 達(dá)等因素都

19、會(huì)導(dǎo)致一些相互矛盾的結(jié)果。還有以前治療因素影響MDRS型及實(shí)驗(yàn)時(shí)間不適當(dāng)?shù)纫蛩囟紩?huì)導(dǎo)致 MDRS達(dá)與引起化療困難的結(jié)果不一致。要解決這些 問(wèn)題我們還有大量的工作要做。作者單位：張真路(430050 武漢市漢陽(yáng)鐵路中心醫(yī)院病理科)吳人亮(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)病理教研室)參考文獻(xiàn)：1 sglke van der Heyden.P-Glycoprotein:clinical significanee andMethods of Analysis.Clinical Laboratory Scienee， 1995, 32(3): 221 2642 柏珊，多藥耐藥基因與腫瘤化療、白血病現(xiàn)代分型.中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤

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