烏梅等提取物的抑菌作用研究【開題報(bào)告】

1、開題報(bào)告藥學(xué)烏梅等提取物的抑菌作用研究一、綜述本課題國內(nèi)外研究動態(tài)，說明選題的依據(jù)和意義烏梅(FuCtuS Mume)是由薔薇科植物梅Pru nus mume (Sieb. ) Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)加工而成。始載于神農(nóng)本草經(jīng)，列為中品。烏梅性平，味酸澀， 歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)，具有斂肺澀腸、生津止渴、驅(qū)蟲止痢的功效。它含有豐富的有 機(jī)酸。如檸檬酸、蘋果酸、草酸、乳酸、琥珀酸、焦精谷氨酸、甲酸、丙酸、乙酸、延 胡索酸等，其中以檸檬酸和蘋果酸含量最高。 此外，烏梅還含黃酮、 萜類、甾醇、 脂類、 揮發(fā)油、生物堿、糖類等化學(xué)成分。烏梅是一味開發(fā)前景廣泛的中藥品種，有相當(dāng)大的挖

2、掘探討的潛力。目前國內(nèi)外許 多科研人士已從藥理作用角度研究，總結(jié)出其以下幾點(diǎn)作用：( 1)驅(qū)蟲作用 實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，烏梅可使蛔蟲活動增強(qiáng)且可使大部分蛔蟲從引流膽 囊中后退。這與烏梅具有收縮膽囊作用，并可增加膽汁分泌、使膽汁趨于酸性和松弛膽 道口括約肌的作用有關(guān)。( 2)對平滑肌的作用 烏梅煎液能增強(qiáng)豚鼠離體膀胱逼尿肌肌條的張力，增加膀 胱逼尿肌肌條的收縮頻率和收縮波平均振幅，其作用機(jī)理可能與興奮細(xì)胞膜膜上 L 型 CaT通道作用有關(guān)。烏梅對豚鼠離體膽囊的作用表現(xiàn)為雙向性反應(yīng)，即低濃度烏梅對膽 囊肌條表現(xiàn)為抑制作用，當(dāng)烏梅累積至一定濃度時，對膽囊肌條的張力呈現(xiàn)為先降低后 增高的雙向性反應(yīng)。(3) 抗

3、腫瘤作用 烏梅煎劑對小鼠肉瘤S80艾氏膠水瘤有抑制作用，體外試驗(yàn)對人 子宮頸瘤 JTC-2s 株的抑制率在 90 以上。體外抗腫瘤及體外免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)結(jié)果表明， 烏梅水提液、醇提液具有抑制人原始巨核白血病細(xì)胞和人早幼粒白血病細(xì)胞生長的作 用，對這兩種細(xì)胞的克隆形成都有不同程度的抑制作用，呈一定的量效關(guān)系。烏梅對 HL-40細(xì)胞的作用機(jī)制之一是抑制了細(xì)胞 DNA合成，并使細(xì)胞停滯于 G2M期。低濃度 烏梅水提液和醇提液對小鼠免疫器官和體液免疫無明顯影響，而高濃度( 10g kg-1)烏 梅水提液則能明顯減輕小鼠胸腺、脾臟、肝臟的重量，但對體液免疫影響不明顯。提示 烏梅抗腫瘤作用通過整體免疫調(diào)節(jié)而達(dá)

4、到的可能性較小，可能以對腫瘤的直接作用為 主。烏梅的抗腫瘤作用與其 pH 值無關(guān)，所含熊果酸具有一定作用，但非主要成分。（4）抗生育作用 烏梅煎液對末孕和早孕大鼠子宮平滑肌均有興奮作用，妊娠子 宮對其尤為敏感，有明顯的抗著床、抗早孕作用。烏梅有較強(qiáng)的殺精子作用，其主要有 效成分為烏梅 - 枸櫞酸，其殺精子機(jī)理為破壞精子的頂體、線粒體及膜結(jié)構(gòu)，最低有效 濃度為 0.09 。同時烏梅 - 枸櫞酸具有良好的阻抑精子穿透宮頸粘液的作用，精子經(jīng)不 同濃度烏梅 - 枸櫞酸作用后，運(yùn)動能力明顯減弱，精子穿透宮頸粘液管的距離與精子受 烏梅-枸櫞酸作用的濃度呈負(fù)相關(guān)。（5）抗過敏作用 烏梅對豚鼠的蛋白質(zhì)過敏性及

5、組織胺休克具有對抗作用，但對組 織胺性哮喘則無對抗作用。（6）抗氧化作用 烏梅對鄰苯三酚及腎上腺素氧化系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基有很強(qiáng)的 清除能力，并在垂直凝膠電泳中表現(xiàn)出抑制氮藍(lán)四唑 （NBT）光化還原的能力。體外試驗(yàn) 表明，烏梅果槳有明顯抗氧化溶血和抗肝勻漿脂質(zhì)過氧化作用，且抑制率和劑量呈正相 關(guān)。（7）解毒作用 烏梅所含琥珀酸是重金屬及巴比妥類藥物中毒的解毒劑，枸櫞酸 可做堿中毒的解毒劑。（8）其他作用 烏梅提取物體外具有抑凝血抗纖溶活性、抗衰老和保肝等作用。 綜上所述，可以看出，目前對烏梅的研究還不夠深入，尤其是從烏梅的化學(xué)成分從藥用的角度研究并不多，烏梅藥理作用機(jī)制研究得較少，烏梅現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)

6、準(zhǔn)仍有較大的 局限性等。應(yīng)結(jié)合藥理分離提取烏梅的有效成分，闡明其藥理作用機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)新的具 有較強(qiáng)活性的化合物創(chuàng)造條件。本文是對烏梅中提取液抑菌的研究。在體其外對大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、 副傷寒桿菌、霍亂桿菌、百日咳桿菌、變形桿菌、炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、類白喉?xiàng)U菌、 人型結(jié)核桿菌、腦膜炎球菌、金葡菌、肺炎球菌、溶血性鏈球菌等均有抑制作用，其醇 浸漬液對沙門氏菌、綠膿桿菌作用敏感，其 MBC 0.015g mL-1。烏梅水煎液對臨床分 離得到的28株腸球菌有很好的抑制作用，其MIC90為1:320。研究發(fā)現(xiàn)烏梅對腦膜炎球 菌有較強(qiáng)的體外抑菌作用。烏梅的抑菌作用強(qiáng)弱受采收、加工、植物基原的影響

7、，以核 仁、果肉均成熟時采收加工的烏梅比其它時期采收加工的烏梅抑菌作用強(qiáng)；燙曬法與烘 干法的加工成的烏梅抑菌效應(yīng)相同， 熏法制成的烏梅對某些菌的作用略優(yōu)于燙曬、 烘法， 松木或雜木熏制的烏梅，對痢疾、傷寒桿菌的敏感度稍有不同，但差異不明顯；比較了不同基原的烏梅，對腸道致病菌均有一定的作用，但對某一細(xì)菌的作用程度稍有差異。二、研究的基本內(nèi)容，擬解決的主要問題：基本內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)對烏梅、仙人掌、芙蓉菊用乙醇等不同溶劑浸提，并對臨床常 見對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶菌等病原菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，確定最佳抑菌提 取物。以抑菌圈直徑為參考，進(jìn)一步考察在不同PH、溫度、時間、光照等提取條件下提取物抗菌效果

8、。旨在探索頗具開發(fā)潛力抗感染的中草藥。擬解決問題： 1、烏梅、仙人掌、芙蓉菊用不同溶劑的提取。2、抑菌圈直徑的測定。3、平板的制備及打孔。4、病原菌的接種及培養(yǎng)。三、研究步驟、方法及措施：1粗提物的制備醇提法：稱取烏梅粉末50g,用95%勺乙醇溶液回流提取2次，每次3 h,倒出兩次的 溶液合并后，過濾后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，將濾液減壓蒸餾至10g,即得烏梅莖 中的抑菌物得到濃縮記為 1 號。酸提法：1、稱取烏梅粉末50g,用石油醚（30-60 C）回流提取2次，每次3 h,倒 出兩次的溶液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的濃縮液記為 2 號。 2、在圓 底燒瓶中加入乙醚溶液回流提取

9、 2次，每次3 h,倒出兩次的溶液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的濃縮液記為 3 號。 3、在圓底燒瓶中加入乙醇水溶液回流提取 2 次，每次 3 h, 倒出兩次的溶液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的濃縮液記為 4號。 4、在圓底燒瓶中加入沸水回流提取 2 次，每次 3 h, 倒出兩次的溶液合并后，用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的濃縮液記為5號。5、在圓底燒瓶中加入1%HCl溶液回流提取 2 次，每次 3 h, 倒出兩次的溶液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的 濃縮液記為 6 號。水提法：稱取稱取烏梅粉末 50g, 用蒸餾水凈泡 48 h, 過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)

10、濃縮，將濾液減壓蒸餾至10g,即得烏梅粉末的抑菌物，記為7號。2 抑菌性的測定3 培養(yǎng)基的制備量取 200ml 蒸餾水于 400ml 的燒杯中放在萬用電爐上加熱至沸騰，然后按 3.5 ：100 的固液比加入7g營養(yǎng)培養(yǎng)基使其溶解制成溶液，然后用三角瓶分裝，于121C的電熱殺 菌鍋中滅菌 20 分鐘，待用。4 試驗(yàn)菌種的活化將斜面培養(yǎng)基上的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌接種到 250mL三角瓶 的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在振蕩培養(yǎng)箱中以120rmin的轉(zhuǎn)速和37C的溫度下活化培養(yǎng)24h 后，移出ImL菌液在相同條件下重復(fù)培養(yǎng)相同時間，得到初始菌液。5 菌懸液的制備用無菌生理鹽水將大腸桿菌、金黃

11、色葡萄球菌、副溶血性弧菌稀釋成濃度都在1×1025× 102CfumL。6 平板的制備刮取每種烏梅提取物于試管中，在每支試管中加入 5毫無水乙醇，用超聲使其溶解 完全。用移液槍移取每種提取物 Iml于其他試管中（該濃度記為100%，再各移取Iml 以該溶液為標(biāo)準(zhǔn)依次稀釋成 75%和 50%濃度的提取液，待用。7 抑菌圈的測定將 7種提取物分別溶于無水乙醇中配制成 1的濃度，用細(xì)菌過濾器過濾除菌，各 種提取物即用及配。將直徑為 6m的無菌濾紙片浸入濃度為I %的藥物中備用。取經(jīng)活 化的斜面菌種加入生理鹽水中，制成抱子濃度在105-106個/ml之間的均一菌懸液，再 取0.1m

12、l菌懸液，加入到裝有無菌的凝固的 PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，涂抹均勻，貼上上 述準(zhǔn)備好的濾紙片，每皿3片。37C下培養(yǎng)2天，測定抑菌圈大小。吸取提取物原液0.25 mL至牛津杯中，注意不要將菌懸液溢出牛津杯外。并用無菌 生理鹽水做空白對照，每個樣品設(shè)三個平行樣，37 C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。測量抑菌圈的大小，結(jié)果取平均值。8最低抑菌濃度（MIC）的測定用倍比稀釋法將一種藥物水溶液稀釋成 4種濃度，在各平皿內(nèi)分別加2mL不同濃度 的稀釋液，每個濃度重復(fù)三個平皿，然后倒入20mL左右已經(jīng)高溫滅菌的固體培養(yǎng)基， 充分混勻，冷卻凝固后，每皿加入 0.2mL 菌懸液涂均，培養(yǎng)(培養(yǎng)方法同上) 。取出觀 察

13、結(jié)果，以不長菌的稀釋液濃度為最小抑菌濃度( MIC)。將原液稀釋成濃度為 0.6g/ml 、0.3g/ml 、0.15g/m 、0.0625g/ml 、0.0313g/ml 、0.0157g/ml 的濃度梯度，吸取各濃度0.25 mL至牛津杯中，并用無菌生理鹽水做空白對照，每個樣 品設(shè)三個平行樣，結(jié)果取平均值，37C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。四、 參考文獻(xiàn)1 陳林，陳鴻平，劉友平等。烏梅不同部位藥理作用研究J。中國藥房，2007, 18(27): 2089-2090。2 周邦靖編著。用中藥的抗菌作用及其測定方法 M 。重慶:科學(xué)技術(shù)出版社重慶分 社,1987.7.3 徐叔云，卞如濂，陳修。藥理實(shí)臉方法學(xué) M 北京:人民衛(wèi)生出版社， 2002: 1363-1342。4 童國忠，石亞素，馬劍茵等。中草藥對海水養(yǎng)殖黃魚病原弧菌抑菌效果研究J。水產(chǎn)科學(xué)， 2007， 26 (8): 436-439。5 李仲興，王秀華，趙建宏等 烏梅對 308 株臨床菌株的抑菌效果 J。 中國中醫(yī)藥信息雜志， 2007， 14(11): 41-42。6 張顯忠，郭愛軍，李艷玲等。中草藥提取物的體外抑菌活性研究J。中華