核酸純度檢測

1、.最近重新研讀了分子克隆第三版， 有一個有趣的小發(fā)現(xiàn)， 好像過去沒聽人說過。一般測核酸濃度都是用 260nm的光吸收值來決定， 同時用 260/280 的比值來判斷有無蛋白質(zhì)污染。 理想的比值是 1.82.0 左右。分子克隆第三版專門提到這種判斷核酸純度的辦法是不可靠的。 原因在于蛋白質(zhì)在 260nm的消光系數(shù)比核酸小很多，即使有相當(dāng)多的蛋白質(zhì)污染，這個比值還是接近于理想的比值。另外， 260/280 比值尤其不能用于評判寡聚核甘酸的純度， 因為嘌呤的消光系數(shù)比嘧啶大好多，寡聚核甘酸嘌呤嘧啶組成很可能不平均，所以很可能出現(xiàn)很純的樣品260/280 比值卻比較小的情況。你所說的 消光系數(shù) ，是否

2、就是吸光值的意思？如果你用連續(xù)波長測過核酸的吸光度時， 就會發(fā)現(xiàn)， OD260,恰好是核酸吸光值最大的時候，從 200-750,是一條曲線， 260 時是波峰，而 280 時，剛好是曲線下降到一半左右時的吸光值。而恰好 280 又是蛋白質(zhì)的最佳吸收值。 如果純的核酸， 那曲線就是標(biāo)準(zhǔn)的， 260/280就是 1.8-2.0 之間，如果混有蛋白質(zhì)，多肽，酚之類的雜質(zhì)，那280 時的吸收峰就變高了，曲線隨之發(fā)生變形， 而 260 時的吸收峰不變。就如你所說的 “原因在 于蛋白質(zhì)在 260nm 的消光系數(shù)比核酸小很多 ”，因此 260 的吸收峰幾乎不變。但 280 時卻不一樣。這時相反，核酸的消化系

3、數(shù)比蛋白質(zhì)小的多，因此，一旦有污染，280 上升很快。因此 260/280 在有污染的情況下就會變小。 所以，用 260/280 的方法，還是比較可靠的。當(dāng)然更可靠的，就是用 200-750 的波長，連續(xù)掃描。直接觀察核酸的整條曲線，那比光靠 260,280 兩個吸收值，肯定要準(zhǔn)確很多。其實平時在我們檢測時，我們也會檢測 230,320,兩個值。至于這兩值的作用，我稍后再說。其實有 230,260,280,320,這四個點?；旧弦材艽_定下這條曲線的該一段的形狀了。A 260 / A 280 的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280 nm。純凈的樣品，比值大于 1.8（DNA ）或

4、者 2.0（RNA ）。如果比值低于 1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A 230 表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于 2.0。A320 檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品， A 320 一般是 0。（ 320差不多也就是那條曲線剛下降到 0 的時候）。所以，當(dāng)我們檢測 260/280 后，如果比值在1.8-2.0 之間時，我們可以說其純度可以，那 OD260 的值就有效。否則， OD260 的值判為無效。你說的嘌噙與嘧啶的吸光值，確實沒錯。但一般情況下，我們測的都是基因組、tRNA ， mRNA 、cDNA ，

5、所以其 CG 含量都比較均勻。都適用于這種方法。然而，在測某些CG含量明顯不均勻的情況下，比如人工合成的寡核苷酸、引物，在CG 含量過大或者過小的情況下，我們就不能用260/280 的方法了。不過一般自已合成的引物，.'.都能保證純度的，買來的引物，或者托公司合成的寡核苷酸，也不需要我們用OD 值方法重新測一下。因為產(chǎn)品包裝上寫著多少個 OD，序列長度，都非常詳細(xì)，純度也是有保證的。當(dāng) OD 260/ OD280 值=1.8 說明所提的 DNA 質(zhì)粒的純度比較高， 所含的 RNA 或蛋白質(zhì)污染很少， 當(dāng) OD 260/ OD280 值>1.8，說明有 RNA 污染，當(dāng) OD 26

6、0/ OD280 值<1.8 時,說明所提的 DNA 中有蛋白質(zhì)或者是抽提時用的苯酚未除凈，樓主所體的質(zhì)粒 DNA 的 260/280 在 2.0 左右，說明有一定的 RNA 污染，在提質(zhì)粒 DNA 中，一般是在提完質(zhì)粒后， 加入 TE 溶液時加入一定量的 RNA 酶。抽提1.5ml 大腸桿菌過夜菌液時，最后加入 20ul 的 TE 溶液時加入 1.5ul 濃度為 10mg/ml 的 RNA 酶，一般就可以完全去除質(zhì)粒中所含的 RNA 污染有關(guān) RNA 的吸光度說明如下：260nm 、320nm 、230nm 、280nm 下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度 )、鹽濃度和蛋白質(zhì)等有機物的吸光度值。 OD260/OD280 （ R）體現(xiàn)了 RNA 中的蛋白質(zhì)等有機物的污染程度， 質(zhì)量較好的 RNA 的 R 值應(yīng)在 1.8 2.0 之間，當(dāng) R<