在位及異位子宮內(nèi)膜組織建立子宮內(nèi)膜異位癥動物模型的研究

1、在位及異位子宮內(nèi)膜組織建立子宮內(nèi)膜異位癥動物模型的研究         【摘要】  目的 建立子宮內(nèi)膜異位癥的種植動物模型，了解正常在位子宮內(nèi)膜、腺肌癥的子宮內(nèi)膜及卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組織在裸鼠體內(nèi)的生長的差異。方法 將正常子宮內(nèi)膜、子宮腺肌癥患者的內(nèi)膜及卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁分別注射到裸鼠腹腔內(nèi)，觀察生長情況，留取標(biāo)本行病理及免疫組化檢查。結(jié)果 3種種植物中以卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁最易種植成功，其次是子宮腺肌癥患者的內(nèi)膜，正常子宮內(nèi)膜種植成功率低于前兩者。免疫組化結(jié)果提示3組種植成功的腺上皮上均有雌激素受體表達，

2、孕激素受體弱表達或不明顯，血管上皮生長因子表達明顯。結(jié)論 腺肌癥的子宮內(nèi)膜及卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組織在裸鼠體內(nèi)更易生長，與正常內(nèi)膜有差異;裸鼠體內(nèi)種植腺體上皮及基質(zhì)均見明顯血管上皮生長因子表達。裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥的動物模型成功建立，為研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機理和藥物治療提供了實驗動物模型。 【關(guān)鍵詞】  子宮內(nèi)膜異位癥; 子宮腺肌癥; 巧克力囊腫; 疾病模型，動物【Abstract】 Objective To establish the implanted animal model of human endometriosis.Methods The eutopic endometr

3、ium of normal women and patients of endometrioma, and the inner tissue of the cystis of ovarian endometriosis were implanted into the abdomen of nude mice respectively. Its growing condition was observed and the specimen was saved for pathology and immunohistochemistry examination .Results Of the th

4、ree tissues, the eutopic endometrium of patients of endometrioma grew most easily. The second wes the inner tissue of the cystis of ovarian endometriosis . The successful implantation rate of the the eutopic endometrium of normal women into the nude mice was the lowerest.Immunohistochemistry examina

5、tion showed that oestrogen receptors were expressed in the glandular epithelia and in stromal cells of endometriotic lesions of the three groups, whereas progesterone receptors were weakly expressed or not expressed .The vascular endothelial growth factor (VEGF) was clearly observed in both the glan

6、dular epithelia and stromal cells of grafts of the three groups.Conclusion The eutopic endometrium of patients with endometrioma and the inner tissue of the cystis of ovarian endometriosis are different from the eutopic endometrium of normal women . They could be more successfully transplanted into

7、nude mice . The successful establishment of the animal model of endometriosis can provide an ideal model for the further investigation of the mechanisms and medical therapy of endometriosis.【Key words】 Endometriosis; Endometrioma; Cystis of ovarian endometriosis; Disease models,animal子宮內(nèi)膜異位癥是一種具有侵襲性

8、的婦科常見病，近年來其發(fā)病率明顯上升，痛經(jīng)、不孕作為其主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重韋與利巴韋利治療，均取得了較好的療效。研究顯示神經(jīng)氨酸酶抑制劑奧司他韋對甲H1N1流感有效。但是應(yīng)用利巴韋利治療的患者也取得了同樣的療效，提示甲H1N1流感病毒對機體有自限性，或者說用利巴韋林也有一定的療效，可能與利巴韋林為廣譜抗病毒藥，其進入被病毒感染的細(xì)胞后迅速磷酸化，其產(chǎn)物作為病毒合成酶的競爭性抑制劑，損害病毒的RNA和蛋白的合成，使病毒的復(fù)制和傳播受抑有關(guān)。本資料也提示輕癥甲型H1N1流感患者無需應(yīng)用奧司他韋。影響患者的生活質(zhì)量。目前關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制尚未最終闡明，藥物治療和術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。由于倫理學(xué)問題

9、，很難在人體中進行內(nèi)膜異位癥的對照研究，更不能反復(fù)進行創(chuàng)傷性檢查。為了研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機理和觀察藥物治療效果，需在動物體內(nèi)復(fù)制出子宮內(nèi)膜異位癥，建立實驗動物模型。裸鼠是一種免疫缺陷性小鼠，將異體組織種植于小鼠體內(nèi)很少發(fā)生排斥反應(yīng)，且價格適中，來源豐富，是建立子宮內(nèi)膜異位癥模型的理想動物。我們用裸鼠成功建立了子宮內(nèi)膜異位癥模型，為進一步探討子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機理、表現(xiàn)方式和鑒定治療的新方法奠定了基礎(chǔ)，現(xiàn)報告如下。1 材料與方法1.1 材料 標(biāo)本來源：正常增生期子宮內(nèi)膜來自40歲取環(huán)的門診婦女;子宮腺肌癥在位宮內(nèi)膜和卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組織來自一位36歲的手術(shù)患者。子宮內(nèi)膜均經(jīng)病理證實為增生

10、期內(nèi)膜。實驗動物：裸鼠，雌性，56周齡，體重1926 g，共20只，由上海實驗動物中心提供，SPF(specificpathogen free)條件下飼養(yǎng)。1.2 方法1.2.1 標(biāo)本處理 標(biāo)本取材后放入含平衡液的無菌瓶中，置冰盒內(nèi)，快速送實驗室(1 h內(nèi)，否則影響接種成功率)1用無菌的平衡液漂洗3次，盡量洗去血塊和黏液，然后于無菌器皿中將其剪成1 mm×2 mm×1 mm大小的片狀物，分裝在盛有2 ml生理鹽水的帶12針頭的無菌注射器中，每個注射器中含內(nèi)膜片12片(在1 h內(nèi)完成，否則影響內(nèi)膜細(xì)胞的存活) 。每次依正常子宮內(nèi)膜、子宮腺肌癥患者的內(nèi)膜及卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組織

11、順序處理標(biāo)本。1.2.2 動物處理 于小鼠腹部正中臍下方消毒后穿刺入腹腔，注入組織碎片及生理鹽水。于當(dāng)天開始于小鼠腿部肌肉注射苯甲酸雌二醇0.02 ml(2 mg/ml)，1次/3 d，以促進種植物的生長25。1.2.3 動物分組 正常子宮內(nèi)膜組6只，子宮腺肌癥在位內(nèi)膜組及卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組織組分別各7只。免疫組化用SP法。2 結(jié)果2.1 種植病灶發(fā)展情況 種植24 d時，各組隨機取2只裸鼠，殺死后檢查腹腔內(nèi)病灶種植情況。3組裸鼠體內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)明顯的肉眼可見的病灶，但腸系膜間均有黏連。留取腹腔內(nèi)組織常規(guī)石蠟包埋，HE染色后病理學(xué)檢查：卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組織組的2只裸鼠大網(wǎng)膜上見有子宮內(nèi)膜的腺體

12、生長，子宮腺肌癥在位內(nèi)膜組的1只裸鼠腸系膜組織中見有子宮內(nèi)膜腺體生長，另1只及正常子宮內(nèi)膜組的2只裸鼠體內(nèi)均未見有子宮內(nèi)膜腺體生長，但可見炎細(xì)胞浸潤。種植40 d時，各組殺死1只檢查：3組裸鼠體內(nèi)均有肉眼可見的結(jié)節(jié)狀物，直徑在23 mm，2只在網(wǎng)膜上，1只在腸壁上，腸系膜上及網(wǎng)膜上見黏連，局部見組織黃染，腹腔及盆腔未見有液體。鏡下檢查3只均見子宮內(nèi)膜腺體生長，在腸壁上生長的腺體有向肌層生長的傾向。種植50 d時，將余下的裸鼠殺死，卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組的4只裸鼠體內(nèi)、子宮腺肌癥在位內(nèi)膜組的4只裸鼠體內(nèi)及正常子宮內(nèi)膜組的2只裸鼠(1只裸鼠自然死亡，因組織自溶未取材)體內(nèi)解剖時均有肉眼可看到的病灶，

13、多數(shù)病灶暗黃色或灰白色，位于腸系膜或網(wǎng)膜上，病灶大小在0.2 cm×0.2 cm左右，有病灶的組織局部呈暗黃色，水腫，裸鼠體內(nèi)均見腸壁間黏連及網(wǎng)膜黏連，均未見明顯盆腹腔積液;病理檢查提示10只裸鼠體內(nèi)均可見到子宮內(nèi)膜腺體生長，腺腔擴張明顯，分泌現(xiàn)象較普遍。2.2 各組之間種植成功情況 各組之間卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組種植成功率最高為100%，明顯高于所有的文獻報道，子宮腺肌癥在位內(nèi)膜組的種植成功率又高于正常在位子宮內(nèi)膜組的種植成功率。見表1。表1 各組種植成功情況         2.3 各組種植成功病灶的病

14、理檢查情況 在24 d時種植成功的病灶中發(fā)現(xiàn)的子宮內(nèi)膜腺體較小，腺上皮細(xì)胞矮立方形，周圍見基質(zhì)細(xì)胞及血管生長，未見有分泌的情況，未見核下空泡;40多天時腺腔擴張明顯，腺上皮細(xì)胞較前增高，呈高立方形，有假復(fù)層現(xiàn)象，分泌現(xiàn)象明顯，可見頂漿分泌及核下空泡，腺腔內(nèi)見有分泌物，分泌后的細(xì)胞成為扁平狀?；|(zhì)內(nèi)及腺上皮周圍血管明顯。基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)見炎細(xì)胞浸潤;并可見基質(zhì)蛻膜樣變化;50 d腺腔擴張明顯，腺上皮細(xì)胞高立方形，有假復(fù)層現(xiàn)象，分泌現(xiàn)象明顯，可見頂漿分泌及核下空泡，腺腔內(nèi)見有分泌物，腺腔周圍可見明顯的較多血管生長，基質(zhì)水腫、炎細(xì)胞侵潤、陳舊性出血及鈣鹽沉積均可見。2.4 種植灶分布情況 本資料發(fā)現(xiàn)20只

15、裸鼠中種植成功16只，在腸壁上見種植灶1只，網(wǎng)膜及腸系膜脂肪組織中見種植病灶15只，子宮及卵巢表面未見明顯病灶生長，與人類的好發(fā)部位不同。人類好發(fā)部位多在子宮、卵巢、子宮直腸窩、盆底等處。2.5 免疫組化檢查 3組種植成功的病灶均行雌激素受體、孕激素受體及血管上皮生長因子(VEGF)的檢查。檢查提示裸鼠體內(nèi)種植成功的子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞上及基質(zhì)細(xì)胞上均有雌激素受體表達，腺上皮上稍強，孕激素受體表達較弱或無;VEGF在子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞上及基質(zhì)細(xì)胞上均有明顯表達。3 討論為研究子宮內(nèi)膜異位癥的病因、發(fā)病機制、發(fā)生發(fā)展、治療和預(yù)防對策，需建立實驗動物模型。子宮內(nèi)膜異位癥動物模型的種類有：自發(fā)性子

16、宮內(nèi)膜異位癥動物模型，如恒河猴、南美獼猴、狒狒等;誘發(fā)性子宮內(nèi)膜異位癥模型，如獼猴模型、家兔模型、大鼠模型等;移植性子宮內(nèi)膜異位癥模型，如裸鼠模型、SCID小鼠模型等。常用的為大鼠模型和小鼠模型。選擇條件以實驗的目的和可行性而異。3.1 裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的優(yōu)缺點 裸鼠是指先天性無胸腺的裸小鼠，具有先天性無胸腺和全身毛發(fā)生長發(fā)育異常兩個主要缺陷特征，是T淋巴細(xì)胞功能缺陷動物，細(xì)胞免疫力低下，但B細(xì)胞功能基本正常，NK細(xì)胞活性較高，可克服異種間的免疫排斥反應(yīng)，接受人類正常和腫瘤組織移植，移植后的組織仍保持原有的組織學(xué)的、染色體的以及生物化學(xué)的特征，并且對各種藥物的敏感性不發(fā)生改變2,3,6。

17、成功率較高。裸鼠遺傳背景明確，體內(nèi)微生物可控制，模型形狀顯著且穩(wěn)定，質(zhì)量和規(guī)格可選擇。裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，觀察周期短，試驗結(jié)果臨床參考意義大。但與其他動物相比，裸鼠存在體積小，抵抗力低下，不能耐受多次手術(shù)采血檢測的缺點。由于其免疫功能缺陷，不能用來研究子宮內(nèi)膜異位癥病灶引起的機體免疫方面的改變。3.2 裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立方法 腹腔注射法：將新鮮的人增生期子宮內(nèi)膜粗制成小碎片，注入裸鼠腹腔內(nèi)。20 d后分期分批處死小鼠，辨別種植的子宮內(nèi)膜組織并切除用于病理分析。本試驗三組腹腔種植法的成功率分別是：正常子宮內(nèi)膜組種植成功率(3/5)為60%;子宮腺肌癥在位內(nèi)膜組(6/7)成功率為85

18、.71%;卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組種植成功率最高(7/7)為100%。有文獻報道腹腔種植法的成功率96.5%100%13,5，種植物保持原組織學(xué)的基本特征，它可在小鼠體內(nèi)存活10周。本試驗總的種植成功率84.2%，較文獻報道的低，可能與取材后處理時間較長有關(guān)。文獻報道卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組種植后異位病灶的病損變化如出血、壞死、鈣化、及纖維組織增生可發(fā)現(xiàn)，但腺管發(fā)現(xiàn)率低24，因為卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁找到腺體較少。本試驗卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組取材時找到了生長旺盛的腺體，所以種植成功的病灶內(nèi)可見生長旺盛的腺體。由此看來取材的好壞對實驗的結(jié)果有很大的影響。3. 3 裸鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的實驗結(jié)果 本實驗采用腹

19、腔種植法，將正常子宮內(nèi)膜、子宮腺肌癥患者的內(nèi)膜及卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁分別注射到裸鼠腹腔內(nèi)，觀察生長情況。卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組種植成功率最高，子宮腺肌癥患者的在位內(nèi)膜組種植成功率亦較正常子宮內(nèi)膜組高。本實驗在種植24 d時解剖部分小鼠未發(fā)現(xiàn)明顯病灶，但鏡下可見有種植成功的腺體;種植40 d后裸鼠體內(nèi)肉眼可見病灶，鏡下見腺腔擴張明顯，腺上皮細(xì)胞高立方形，腺腔周圍可見明顯的較多血管生長，基質(zhì)水腫、炎細(xì)胞侵潤、陳舊性出血及鈣鹽沉積均可見。故認(rèn)為飼養(yǎng)時間短，病灶小不易觀察，取材時易有疏漏，飼養(yǎng)時間夠長，種植病灶能夠充分生長，易于觀察、易于取材鏡下組織反應(yīng)亦明顯。3.4 異位病灶的部位 Nisolle等觀察

20、到種植后裸鼠體內(nèi)黏連多發(fā)生在側(cè)腹部和腹部脂肪組織間。本實驗中發(fā)現(xiàn)種植成功的病灶多在網(wǎng)膜及腸系膜中，腸壁上也可見到，與文獻報道的相同。但與人類子宮內(nèi)膜異位病灶發(fā)生部位不同，人類主要在子宮直腸窩、膀胱、卵巢及直腸等盆腔部位，這可能與人取直立姿勢、小鼠取俯臥姿勢，不同的重力作用有關(guān)。3.5 各組不同的種植率 提示正常子宮內(nèi)膜、卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁組織及子宮腺肌癥在位內(nèi)膜組織之間有著某些差異。在裸鼠體內(nèi)不同的種植成功率說明3種不同的種植物對組織的侵襲能力不同。有文獻報道異位的內(nèi)膜中血管生長因子水平高于正常子宮內(nèi)膜，粘附因子水平亦高于正常，故易于生長。3組種植成功的病灶中免疫組化檢查成功種植的病灶腺上皮及

21、基質(zhì)細(xì)胞上均有明顯的VEGF 表達，VEGF可促進血管的生長，雌激素受體較孕激素受體表達明顯說明異位的內(nèi)膜對孕激素的作用不明顯。有文獻報道 免疫組化檢查提示VEGF在子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞上及基質(zhì)細(xì)胞上均有明顯表達。理想的動物模型應(yīng)盡可能與人類疾病生長進程及功能相似，且規(guī)范化，能夠準(zhǔn)確地再現(xiàn)該疾病的特點，反映疾病的發(fā)展變化，還應(yīng)在臨床上有實用性和可控性，復(fù)制時經(jīng)濟易行。本實驗證實裸鼠卵巢巧克力囊腫內(nèi)壁、子宮腺肌癥患者的在位內(nèi)膜移植成功率高，移植后組織仍保持原有的組織形態(tài)及生化特征。相對靈長類動物而言價廉易得，便于管理，為建立以位癥模型的理想動物?！緟⒖嘉墨I】  1 Awwad JT,Sayegh RA,Tao XJ,et al.The SCID mouse:an experimental model for endometriosisJ.Hum Repro,1999,14(12):31073111. Bergqvist A,Jeppsson S,Kullander S,et al.Human endometrium transplanted into nude miceJ.Am.J.Pathol.1985,119(2):336344. Zamah NM, Dodson G,St