單細胞凝膠電泳法檢測苯作業(yè)工人淋巴細胞DNA損傷

1、論著單細胞凝膠電泳法檢測苯作業(yè)工人淋巴細胞DNA 損傷邢彩虹 李桂蘭 李玉英 曲青山 常平 穆瑞東 王援相 尹松年(本文圖1見封四摘要! 目的 用堿性單細胞凝膠電泳技術檢測苯作業(yè)工人外周血淋巴細胞DNA 損傷, 研究苯的遺傳毒性。方法 采用堿性單細胞凝膠電泳技術。將接苯工人按累積濃度、歷史平均濃度和測定當時8h 時間加權平均濃度(8h TWA 分組。觀察指標包括DNA 斷裂分級(將DNA 斷裂損傷細胞按其損傷程度分級 及DNA 彗星尾長(彗頭末端到彗尾的長度 。結(jié)果 接苯工人DNA 斷裂程度及DNA 彗星尾長lg(尾長+1 兩個參數(shù), 接苯組按累積濃度、歷史平均濃度和8hTWA 濃度計算, 均

2、明顯高于對照組, 差異有顯著性(P <0. 01 , 并有明顯的劑量-反應關系。結(jié)論 彗星試驗能夠快速、敏感地檢測苯引起的人類淋巴細胞DNA 損傷, 提示對于檢測環(huán)境致癌物和致突變物可能是一有用工具。關鍵詞! 苯; 單細胞凝膠電泳(彗星試驗 ; DNA 損傷Study of DNA dam age among workers exposed to benzene by alkaline single cell gel electrophoresis detection XING Caihong *, LI Guilan, LI Yuying, et al. *Institute o f

3、Occu pationa l Medicine, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijin g 100050, ChinaAbstract ! Objective To detect DNA damage in peripheral lymphocytes of workers exposed to benzene by alka li ne single cell gel electrophoresis and to study the genetic toxicity of benzene. Methods Alkali ne singl

4、e cell gel elec trophoresis(Comet assay was used.T he workers were divided into different group s by levels of accumulative exposure, his torical average and the eight hour time weigh ted average(8h TWA . The grade of DNA breakage and tail length of Comet assay were used to measure DNA damage. Resul

5、ts The grade of DNA breakage, the tail lengthlg(tail+1 and levels of accu mulative exposure, historical average and 8h TWA were significantly higher in lymphocytes of exposed workers, compared to matched controls(P <0. 01 . The dose response relationship was significant in the above three benzene

6、 con centrations. Conclusion Comet assay could sensitively and more conveniently detect DNA damage induced by benzene in human lymphocytes. It may be a useful tool for hu man bi omonitoring, particularly for the analysis of environ mental muta gens and carcinogens.Key w ords ! Benzene; Single cell g

7、el electrophoresis(SC GE, comet assay ; DNA damage以往大量實驗和現(xiàn)場研究資料表明, 苯是一典型致突變劑, 可以引起動物和人體染色體的廣泛損傷。彗星試驗作為一種檢測DNA 損傷的技術, 已成為檢測苯引起DNA 損傷及苯的遺傳毒性的有效方法。Plappert 等1證明單細胞凝膠電泳試驗(SCGE可在染苯小鼠的肝臟和血細胞中檢測DNA 的損傷。在苯暴露工人外周血淋巴細胞中也多次檢測出了DNA 損傷2, 3。為研究苯引起DNA 損傷的劑量-反應關系, 我們用彗星試驗檢測了苯作業(yè)工人外周血淋巴細胞的DNA 損傷。對象與方法1. 研究對象:接苯工人組46人

8、, 分別選自制鞋作者單位:100050北京, 中國預防醫(yī)學科學院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病研究所(邢彩虹、李桂蘭、常平、尹松年 ; 天津市勞動衛(wèi)生職業(yè)病研究所(李玉英、穆瑞東、王援相 ; 紐約大學醫(yī)學中心環(huán)境醫(yī)學研究所(曲廠及體育用品廠; 對照組工人26人, 選自糧庫管理人員。工人接苯水平按以下3種方法計算:(1 將從事接苯工作各年接苯平均濃度接苯工齡的總和作為工人一生接苯總量, 即累積濃度。共分3組:<150、150300、>300mg m -3 a -1; (2 收集工人從事接苯工作以來歷史定點測定濃度水平, 以工種為單位計算歷史接苯平均濃度。共分2組:<16. 5, #16. 5

9、mg/m 3; (3 現(xiàn)接苯水平(8h TW A 用美國3M 公司個體采樣器采樣分析, 共分3組:<16. 5、16. 540、>40mg/m 3。2. 彗星試驗檢測方法:單細胞凝膠電泳參照Singh 等4方法略加改進后進行, 主要有以下步驟:(1 分離細胞:取靜脈血10ml, 肝素抗凝、離心, 分離出白細胞, 用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞, 用PBS 調(diào)整細胞濃度為106107個/ml 。(2 制片:在磨毛玻片兩端(一端做平行對照 各鋪200 l 正常熔,后揭去蓋玻片, 取30 l 細胞懸液與45 l 低熔點瓊脂糖(LMP A 混勻后鋪于第一層瓊脂上, 加上蓋玻片, 4冷凝10

10、min 5。(3 裂解:揭去蓋玻片, 將膠板輕輕放入預冷的(用前加入體積分數(shù)為1%的Tri ton X 100細胞 裂解液中, 裂解至少1h 。(4 電泳:將膠板放入新配制的電泳緩沖液中, 靜置20min, 使DNA 雙鏈解螺旋, 然后在25V 、300m A 條件下電泳20min 。(5 中和及染色:以0. 4mol/LTris 中和后, 用碘化丙啶染色。(6 彗星圖像分析:熒光顯微鏡(400倍 下觀察, 每片計數(shù)50個細胞。選用DNA 斷裂分級及DNA 彗星尾長兩種觀察指標。DNA 斷裂分級按彗星尾部長度占總長的比例判斷:(圖1 0級:<5%; 1級:5%; 2級20%; 3級:40

11、%95%; 彗星尾長為彗頭末端到彗尾的長度。以50200 mol/L H 2O 2室溫(12 培養(yǎng)正常人淋巴細胞1h, 作為陽性對照。3. 統(tǒng)計學分析方法:DNA 斷裂分級比較, 采用 2檢驗及線性趨勢檢驗; 彗星尾長比較, 采用秩和檢驗; 相關與回歸分析; 將尾長取對數(shù)lg(尾長+1 接近正態(tài)分布后, 用方差分析。結(jié) 果1. 方法可靠性探討:陽性對照物H 2O 2(50200 mol/L證明可引起人淋巴細胞DNA 彗星尾長顯著改變, 并呈劑量-反應關系。2. 接苯組與對照組研究對象的年齡、性別、吸煙分布, 差異均無顯著性(P >0. 05 。3. DNA 斷裂分級和彗星尾長兩參數(shù)表示D

12、NA 損傷(表1表3 , 接苯組明顯高于對照組, 差異有顯著性(P <0. 01 。4. DNA 斷裂分級比較:按累積濃度(表1 、歷史接苯平均濃度(表2 以及8h TW A 濃度(表3 分組的各濃度組(以下簡稱3種濃度組 均明顯高于對照組, 差異有顯著性(P <0. 01 , 不同接苯濃度組之間兩兩比較, 差異均有顯著性(P <0. 01 ; 并存在劑量-反應關系(線性趨勢檢驗P <0. 01 。5. 彗星尾長比較:按歷史接苯平均濃度(表2 以及8h TWA 濃度(表3 分組的低濃度組彗星尾長均明顯高于對照組, 差異有顯著性(P <0. 05 , 其他各濃度組與

13、對照組差異無顯著性(P >0. 05 。表1 不同累積濃度的接苯工人DNA 斷裂分級及其%彗星&尾長組別(mg m -3 a -1 人數(shù) 細胞數(shù) D NA 斷裂分級(細胞數(shù) 0123細胞損傷率(% 算術均數(shù) x s 幾何均數(shù) Gg苯工人組462300 139510. 61 13. 46 <150227100 733 5816514433*#8. 218. 02 0. 83( 0. 3415030013650 383 3711711341*#8. 577. 550. 85(0. 35 >30011550279598912349*#17. 832

14、3. 170. 99(0. 52對照組261300 1164 268129101. 972. 860. 370. 28P <0. 01( 檢驗 ; 各濃度組間比較, P <0. 01; 幾何均數(shù)取自x =lg(x +1 (x 為尾長幾何數(shù)值, x 為尾長算術數(shù)值 ; 彗星尾長算術均數(shù)與對照組比較, P <0. 05(秩和檢驗 ; 彗星尾長幾何均數(shù)與對照組比較, (P <0. 05(秩和檢驗表2 不同歷史濃度的接苯工人DNA 斷裂分級及其%彗星&尾長組別(mg/m3 人數(shù) 細胞數(shù) D NA 斷裂分級(細胞數(shù) 0123細胞損傷率(% 算術均數(shù) x s 幾何均數(shù) Gg

15、苯工人組462300 1395 10. 61 13. 46 <16. 5341700 1087 102 28123036*#8. 027. 79 0. 83( 0. 32#16. 512600308529015049*#17. 953. 441. 00(0. 52對照組261300 1164 268129101. 972. 860. 370. 28P <0. 01( 檢驗 ; 各濃度組間比較, P <0. 01; 幾何均數(shù)取自x =lg(x +1 (x 為尾長幾何數(shù)值, x 為尾長算術數(shù)值 ; 彗星尾長算術均數(shù)與對照組比較, P <0. 05(

16、秩和檢驗 ; 彗星尾長幾何均數(shù)與對照組比較, (P <0. 05(秩和檢驗表3 不同8h TWA 濃度的接苯工人DNA 斷裂分級及其%彗星&尾長組別(mg/m3 人數(shù) 細胞數(shù) D NA 斷裂分級(細胞數(shù) 0123細胞損傷率(% 算術均數(shù) x s幾何均數(shù) Gg苯工人組462300 1395 10. 6113. 46<16. 5231150 829 671668828*#5. 655. 49 0. 72( 0. 2916. 54015750 423 5412614744*#10. 158. 750. 91(0. 37 >4084001433379

17、14564*#25. 7423. 981. 27(0. 40對照組261300 1164 268129101. 972. 860. 370. 28值 , P <0. 05( ; , (0. 05(秩和檢驗將尾長取對數(shù)lg(尾長+1 后, 3種濃度組的各濃度組尾長均明顯高于對照組, 差異有顯著性(P <0. 05 。除按8h TW A 濃度分組的低濃度組和中濃度組與高濃度組間差異有顯著性(P <0. 05 外, 其他各濃度組間兩兩比較差異均無顯著性(P >0. 05 , 但可看到在3種濃度組中隨濃度增加尾長均有增加趨勢。作回歸和相關分析, 在散點圖上未發(fā)現(xiàn)3種濃度下彗星尾

18、長分布有明顯直線或曲線趨勢, 尾長與累積濃度、歷史接苯平均濃度、8h TW A 濃度間無明顯相關關系。討 論彗星試驗在苯的體內(nèi)遺傳毒性研究中, 與微核實驗、姊妹染色單體交換、染色體畸變相比同樣敏感, 且具有簡便、快速等優(yōu)點。本試驗中改進了傳統(tǒng)的三層凝膠方法, 只鋪二層, 使操作更簡單, 鏡下觀察細胞核形態(tài)更清晰。也有人建立了帶槽磨毛載玻片加蓋玻片進行單層灌膠的方法6, 操作更為方便。本試驗中, 無論是按工人一生接苯累積濃度、歷史平均接苯濃度還是按8h TWA 濃度分析, 接苯工人DNA 單鏈斷裂程度隨接苯濃度的增加而增加, 并呈明顯的劑量-反應關系。雖然在散點圖上3種濃度下的彗星尾長分布均無明

19、顯的直線或曲線趨勢, 但就分組而言, 各濃度組尾長及取對數(shù)后的尾長均隨濃度增加而增加, 且取對數(shù)后的尾長均明顯高于對照組, 提示, 彗星尾長可以作為分析DNA 損傷的指標應用于群體分析。另外, 各濃度組間尾長兩兩比較差異無顯著性可能是因為樣本例數(shù)較少所致。有文獻報道, 接苯組DNA 損傷明顯高于對照組2, 7, 但未進一步證明苯暴露所引起的DNA 損傷的劑量-反應關系。也有報道, 高濃度接苯組(879. 0、376. 0mg/m 3和低濃度接苯組(172. 0mg/m3 DNA 損傷率與對照組差異無顯著性3。我們的試驗顯示, 這種劑量-反應關系可能由于隨著苯濃度增高, DNA 快速修復功能不能

20、與越來越多的損傷平衡, 使DNA 損傷加重所致。由于苯引起DNA 損傷是一個長期的過程, 雖然累積濃度與彗星尾長的相關性(r 2=0. 05 較低, 但按累積濃度分析DNA 斷裂分級及彗星尾長結(jié)果差異均有顯著性(P <0. 01 , 因此, 按累積濃度計算的工人總接苯量分析苯引起的DNA 損傷應更有價值。苯代謝物的遺傳毒性可能是由于細胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1, C YP 2E1 和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO 將苯代謝為相關的毒性代謝CYP 2E1的催化作用被激活而引起骨髓毒性, 用選擇性CYP 2E1丙烯乙二醇抑制劑預處理后,

21、可降低受試物的DNA 損傷率8。該試驗與甲苯可以減少血液和骨髓細胞中苯的毒性報告一致9, 甲苯可能是抑制了CYP 2E1的代謝作用從而減少苯的代謝作用。但也有報道, 苯與甲苯混合暴露的工人外周血淋巴細胞DNA 損傷明顯增加7, 說明甲苯的損傷作用不可低估, 甲苯的遺傳毒性機制還有待進一步研究。在體外試驗中, 苯代謝物苯醌、氫醌和苯三酚可以引起人淋巴細胞DNA 單鏈斷裂和堿性不穩(wěn)定損傷, 在低劑量范圍內(nèi)(<1 g/ml 尾長隨濃度增加而增加, 當濃度進一步增高時, 尾長的增高趨勢將趨向穩(wěn)定, 這可能是導致自由基形成的苯內(nèi)源性代謝活化作用在某一階段達到飽和所致2。苯及其代謝物不象電離輻射、氧

22、化劑那樣直接誘導DNA 損傷, 而是與DNA 共價結(jié)合形成加合物10, 在核酸內(nèi)切酶的作用下進行切除修復, 增加DNA 的不穩(wěn)定性, 導致基因突變和染色體畸變11。DNA 損傷與腫瘤發(fā)生有一定的關系, 由于SC GE 對低水平的DNA 損傷極其敏感, 因此, SCGE 可用于人類遺傳損傷生物監(jiān)測, 特別是作為職業(yè)有害因素對健康影響的早期監(jiān)測指標有更好的應用前景。參 考 文 獻1Plappert U, Barthel E, Seidel HJ, et al. Reduction of benzene toxicity by toluene. Environ Mol Mut, 1994a, 24:

23、283 292.2Andreoli C, Leopardi P, Crebelli R. Detec tion of DNA damage in humanlymphocytes by al kali ne single cell gel electrophoresis af ter exposure to benzene of benzene metabolites. Mut Res, 1997, 377:95 104.3袁野, 鄔堂春, 陳勝, 等. 苯作業(yè)工人淋巴細胞DN A 損傷的研究.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病, 1996, 22:80 82.4Si ngh NP, M ccoy MT, Tice RR, et al. A s imple technique for quantitati onof low levels of DNA damage in indi vidual cells. Exp Cell Res, 1988, 175:184 191.5Vis vardis EE, Tas siou AM , Pi peraki s SM, et al. Study of D NA da mage in