SDS-PAGE電泳

1、SDS-PAGESDS-PAGE楊兵楊兵主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 一、一、SDS-PAGESDS-PAGE簡介簡介 二、實驗試劑與器材二、實驗試劑與器材 三、實驗步驟三、實驗步驟 四、注意事項四、注意事項一一. . SDS-PAGESDS-PAGE（簡介）（簡介）SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGESDS-PAGE） ：o 什么是聚丙烯酰胺凝膠？什么是聚丙烯酰胺凝膠？o 加入加入SDSSDS的作用？的作用？o SDS-PAGESDS-PAGE的用途？的用途？o SDS-PAGESDS-PAGE分離蛋白質(zhì)的原理？分離蛋白質(zhì)的原理？o SDS-PAGESDS-PAGE的

2、優(yōu)缺點？的優(yōu)缺點？垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置樣品遷樣品遷移方向移方向加樣加樣1.1.聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠是由單體聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)(Acr)和交和交聯(lián)劑聯(lián)劑N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(Bis)(Bis)在加速劑在加速劑N N，N N，N N ，N N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)和和催化劑過硫酸銨催化劑過硫酸銨(AP)(AP)或核黃素或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳

3、膠電泳(PAGE)(PAGE)。 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈于它所帶凈電荷電荷以及以及分子大小分子大小和和形狀形狀等因素。等因素。 當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDSSDS，由于十二烷基硫酸根帶負電，使，由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質(zhì)各種蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，荷差別，SDSSDS與蛋白

4、質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)復(fù)合物形成近似合物形成近似“雪茄煙雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDSSDS復(fù)合物的復(fù)合物的短軸長度都一樣，短軸長度都一樣，SDSSDS消去了蛋白質(zhì)電泳時的電荷和分子大消去了蛋白質(zhì)電泳時的電荷和分子大小的因素，使蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分小的因素，使蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。2.2.加入加入SDSSDS的作用：的作用：3. 3. SDS-PAGESDS-PAGE的用途：的用途：主要用于測定蛋白質(zhì)

5、分子量。主要用于測定蛋白質(zhì)分子量。o 當(dāng)分子量在當(dāng)分子量在15KD15KD到到200KD200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式： logMW=K-bX logMW=K-bX 式中：式中：MWMW為分子量，為分子量，X X為遷移率，為遷移率，k k、b b均為常數(shù)。均為常數(shù)。 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得

6、分行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。子量。丙烯酰胺濃度（丙烯酰胺濃度（% %）線性分離范圍（線性分離范圍（kDkD） 1515121243431010161668687.57.5363694945.05.05757212212分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 4. 4. SDS-PAGESDS-PAGE分離蛋白質(zhì)的原理分離蛋白質(zhì)的原理o 分子篩效應(yīng)：分子篩效應(yīng)：蛋白質(zhì)分子在蛋白質(zhì)分子在SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠中聚丙烯酰胺凝膠中電泳時電泳遷移率主要取決于它的分子量，分子量越小，電泳時電泳遷移率主要取決于它的分子量，分子量越小，遷移率越快。遷移率越快。

7、o 凝膠由分離膠和濃縮膠組成：凝膠由分離膠和濃縮膠組成： 上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒有分子篩效應(yīng)，上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒有分子篩效應(yīng)，其其pHpH為為6.86.8，由于快慢離子所形成的高電壓梯度，使得，由于快慢離子所形成的高電壓梯度，使得變性蛋白質(zhì)分子在泳動中被壓縮為很薄的一層，大大提變性蛋白質(zhì)分子在泳動中被壓縮為很薄的一層，大大提高了分辨率。高了分辨率。 下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分子篩效應(yīng)，下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分子篩效應(yīng)，pHpH為為8.88.8，變性蛋白質(zhì)分子所帶負電荷基本一致，泳動速，變性蛋白質(zhì)分子所帶負電荷基本一致，泳動速度主要決定于分子量。度主要決定于分子

8、量。蛋白分子遷移規(guī)律：蛋白分子越小，遷移速率越快。蛋白分子遷移規(guī)律：蛋白分子越小，遷移速率越快。混合樣品混合樣品帶孔膠帶孔膠 按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子大分子大分子5 5、SDS-PAGESDS-PAGE優(yōu)缺點優(yōu)缺點優(yōu)點：設(shè)備簡單、快速、分辨率和靈敏度高，優(yōu)點：設(shè)備簡單、快速、分辨率和靈敏度高， 特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和 分分子量的測定子量的測定 。缺點：有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血缺點：有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們在變性劑和強還原劑的

9、紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們在變性劑和強還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類的蛋作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類的蛋白質(zhì)，白質(zhì)，SDS-PAGESDS-PAGE測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量子量，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量。，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量。二二. .實驗試劑與器材實驗試劑與器材o 1.1.試劑：試劑： (1) 30%(1) 30%丙烯酰胺丙烯酰胺 (2) 10%SDS (2) 10%SDS (3) (3)分離膠緩沖液分離膠緩沖液:3.0mol/L Tris-HCl pH 8.8 :3.0mol/L Tris-

10、HCl pH 8.8 (4) (4)濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液: 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8: 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 (5) 10% (5) 10%過硫酸銨過硫酸銨(APS)(APS)溶液溶液 (6) (6) 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED) (7) (7) 上樣緩沖液上樣緩沖液:Tris-HCl:Tris-HCl、 SDSSDS、溴酚藍、甘油、溴酚藍、甘油、 2-2-巰基巰基乙醇乙醇 (8) (8) 電極緩沖液（電極緩沖液（Tris-Tris-甘氨酸緩沖液）甘氨酸緩沖液） (9) (9) 染色液染色液: :甲醇、水甲醇、水 、冰

11、乙酸、冰乙酸 、考馬斯亮藍、考馬斯亮藍R250 R250 (10) (10) 脫色液脫色液: :甲醇、水甲醇、水 、冰乙酸、冰乙酸 2.2.實驗器材：實驗器材：o 垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置o 電泳儀電泳儀 o 脫色搖床脫色搖床o 移液槍移液槍o 濾紙濾紙 o 大培養(yǎng)皿大培養(yǎng)皿垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置電泳槽（電泳槽（1 1）、電泳架、灌膠架（）、電泳架、灌膠架（2 2）、灌膠架夾（）、灌膠架夾（3 3）、橡膠墊（）、橡膠墊（4 4）、）、長玻璃板（長玻璃板（5 5）、短玻璃板（）、短玻璃板（6 6）、樣品梳（）、樣品梳（7 7）、加樣器（）、加樣器（8 8）。）。三三. .實驗步驟實驗步

12、驟1. 1. 安裝制膠模具。安裝制膠模具。 2. 2. 分離膠的制備與加入：分離膠的制備與加入：按規(guī)定的比例制備分離膠；按規(guī)定的比例制備分離膠；將分離膠充分混將分離膠充分混合后，小心倒入膠模中再在膠面上覆上一層水，水平靜置至膠體凝固合后，小心倒入膠模中再在膠面上覆上一層水，水平靜置至膠體凝固（室溫不同，聚合時間不同）。（室溫不同，聚合時間不同）。3. 3. 倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干。倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干。 4. 4. 濃縮膠的制備與加入：濃縮膠的制備與加入：按規(guī)定的比例制備濃縮膠；按規(guī)定的比例制備濃縮膠；倒入混合好的濃倒入混合好的濃縮膠，插入梳子（注意避免氣泡產(chǎn)生），梳子底部與

13、分離膠的前沿距離縮膠，插入梳子（注意避免氣泡產(chǎn)生），梳子底部與分離膠的前沿距離約約1cm1cm，水平放置直到膠體凝固。，水平放置直到膠體凝固。分離膠配制分離膠配制試劑名稱試劑名稱12.512.5濃度濃度水水5.3 ml5.3 ml分離膠緩沖液（分離膠緩沖液（pH8.8pH8.8）1.5 ml1.5 ml20%20%十二烷基硫酸鈉溶液十二烷基硫酸鈉溶液0.08 ml0.08 ml30%30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液5.0 ml5.0 ml1010過硫酸銨溶液過硫酸銨溶液0.1 ml0.1 ml四甲基乙二胺四甲基乙二胺0.01 ml0.01 ml總體積總體積11.99 ml11.99 ml濃縮膠配

14、制濃縮膠配制試劑名稱試劑名稱5 5濃度濃度水水2.4ml2.4ml濃縮膠緩沖液（濃縮膠緩沖液（pH6.8pH6.8）1.3 ml1.3 ml20%20%十二烷基硫酸鈉溶液十二烷基硫酸鈉溶液0.025 ml0.025 ml30%30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液0.8 ml0.8 ml1010過硫酸銨溶液過硫酸銨溶液0.05 ml0.05 ml四甲基乙二胺四甲基乙二胺0.005 ml0.005 ml總體積總體積4.58 ml4.58 ml出現(xiàn)明顯界面時，出現(xiàn)明顯界面時，分離膠凝聚完成分離膠凝聚完成（ minh）倒出水或正丁醇，倒出水或正丁醇，并用濾紙吸干并用濾紙吸干v制備分離膠制備分離膠封水的目的是

15、使分離膠上表面平直，并排除氣泡。封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。加入濃縮膠溶加入濃縮膠溶液液 pH6.8v制備濃縮膠制備濃縮膠樣梳需一次平穩(wěn)插入樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳梳口處不得有氣泡口處不得有氣泡,梳底需梳底需水平。水平。插入樣品梳插入樣品梳5. 5. 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：標(biāo)準(zhǔn)品按說明書進行處理，標(biāo)準(zhǔn)品按說明書進行處理，供試品供試品 溶液的制備：按各品種項下規(guī)定制備。溶液的制備：按各品種項下規(guī)定制備。6. 6. 加樣：加樣：待濃縮膠溶液聚合后小心拔出樣品梳，將電極緩沖待濃

16、縮膠溶液聚合后小心拔出樣品梳，將電極緩沖 液注滿電泳槽前后槽，在供試品孔中加入供試品溶液和標(biāo)液注滿電泳槽前后槽，在供試品孔中加入供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（加樣量參照各品種項下規(guī)定）準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（加樣量參照各品種項下規(guī)定）。7. 電泳：電泳：垂直板電泳：恒壓電泳，初始電壓為垂直板電泳：恒壓電泳，初始電壓為80V80V，進入分，進入分離膠時調(diào)至離膠時調(diào)至150150200V200V，當(dāng)溴酚藍遷移至膠底處，停止電，當(dāng)溴酚藍遷移至膠底處，停止電泳。泳。v上樣及電泳上樣及電泳8.8.剝膠：剝膠：電泳完成后，關(guān)閉電泳儀，拔出電極線。打開蓋子，電泳完成后，關(guān)閉電泳儀，拔出電極線。打開蓋子，取出電泳模塊，打

17、開密封夾，取出玻璃板（凝膠）。將玻取出電泳模塊，打開密封夾，取出玻璃板（凝膠）。將玻璃板取出置于水中，輕輕用撬膠板（綠色）撬開玻璃板，璃板取出置于水中，輕輕用撬膠板（綠色）撬開玻璃板，讓凝膠滑入水中。讓凝膠滑入水中。9.9.染色：染色：用至少五倍體積染色液浸泡凝膠，于平緩搖擺平臺用至少五倍體積染色液浸泡凝膠，于平緩搖擺平臺上室溫上室溫1h1h左右。左右。10.10.脫色：脫色：用水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，至蛋白質(zhì)條帶用水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，至蛋白質(zhì)條帶 清晰。清晰。四、注意事項四、注意事項（1 1）安裝電泳槽時要注意均勻用力防止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。）安裝電泳槽時要注意均勻用力防止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。（2 2）雖然應(yīng)用過硫酸銨）雖然應(yīng)用過硫酸銨TEMEDTEMED催化后灌膠催化后灌膠151520 min20 min即可觀察到凝膠的即可觀察到凝膠的形成，但至少需形成，但至少需40 min40 min才能保證才能保證9595以上的單鏈聚合成長短以及具有以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。合適的孔徑大小。