桑色素對小鼠T淋巴細胞體外活化、 增殖和細胞周期的影響

1、桑色素對小鼠T淋巴細胞體外活化、 增殖和細胞周期的影響                作者：臧寧, 曾耀英, 黃秀艷, 王通, 葉雪儀, 周建國, 王會營 【關(guān)鍵詞】  桑色素;,T細胞活化;,增殖;,細胞周期The effect of morin on activation, proliferation and cellcycle of murine T lymphocytes in vitroAbstract  AIM: To di

2、scover the effects of morin on the activation, proliferation and cellcycle of murine T lymphocytes in vitro. METHODS: Murine lymph nodederived T lymphocytes were separated and stimulated with concanavalin A (ConA) and different experimental groups were set by cocultured with morin of different final

3、 concentration. Flow cytometry (FCM) was used to detect the activation, proliferation carboxylfluorescein diacetate, succinimide ester (CFDASE) staining and cellcycle propidium iodide(PI) staining of T cells. RESULTS: After 6 h time of culture in vitro, the  rate of CD69+ T cells in control gro

4、up was (2.97±0.12)%, while it was significant higher in ConA group(72.52±0.66)% (P0.01). Morin could downregulate this rate at final concentration being 25, 50 and 100 mol/L, with a peak at 100 mol/L morin(48.95±0.81)% (P0.01). CFDASE staining showed that at 48 h and 72 h, the prolife

5、ration indexes (PI) of T cells in ConA group were (1.58±0.04) and (1.95±0.02), respectively. Morin could significantly decrease the PI value at all experimental concentration, with the peak effect at 100 mol/L morin, which the PI for 48 h was (1.02±0.02) and (1.03±0.01) for 72 h

6、(P0.01). FCM analysis of PI staining implied that the percentage of S phase cells in ConA group was (27.05±0.39)%, significantly higher than that in control group (5.10±0.07)%; and the 25 and 50 mol/L morin groups showed higher S phase cell rates. CONCLUSION: Morin can significantly inhibi

7、t ConA stimulated activation and proliferation of murine T lymphocytes, in which the S phase lagging may serve as one of the major mechanisms. Keywordsmorin; T cells activation; proliferation; cell cycle摘 要  目的: 研究桑色素(morin)對小鼠T淋巴細胞活化、 增殖和細胞周期的影響。方法: 以刀豆蛋白A(ConA)刺激培養(yǎng)的淋巴結(jié)來源的小鼠淋巴細胞, 再以不同終濃度的morin

8、與T細胞共培養(yǎng), 利用流式細胞術(shù)(FCM), 檢測早期T細胞活化的標志CD69分子的表達, 以羧基熒光素雙醋酸鹽琥珀酰脂(CFDASE)染色檢測T細胞的增殖; 以碘化丙錠(PI)染色分析T細胞的細胞周期。結(jié)果: 小鼠T細胞培養(yǎng)6 h后, 未經(jīng)ConA刺激的對照組中CD69+T的細胞比率為(2.97±0.12)%, 經(jīng)ConA刺激的CD69+T細胞的比率明顯增高, 達到(72.52±0.66)%, 與對照組相比差別明顯(P0.01)。終濃度為25、 50、 100 mol/L的morin均下調(diào)CD69+T細胞的比率, 其中, 100 mol/L的morin抑制作用最強, 為(

9、48.95±0.81)%, 與對照組比較具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。CFDASE染色分析顯示, ConA組培養(yǎng)48 h和72 h的T細胞的增殖指數(shù)（PI）分別為(1.58±0.04)和(1.95±0.02), 各濃度的morin對ConA刺激的T細胞增殖, 具有明顯地抑制作用, 以100 mol/L的morin抑制作用最明顯。培養(yǎng)48  h的ConA組T細胞的PI為(1.02±0.02)、 培養(yǎng)72 h的ConA組T細胞的PI為(1.03±0.01), 與相應時間的對照組比較, 均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。PI染色后流式細胞術(shù)分析

10、的結(jié)果表明, ConA組處于S期的T細胞的比率為(27.05±0.39)%, 顯著高于對照組的比率(5.10±0.07)%。morin組中S期的細胞比率較高。 結(jié)論:  Morin可顯著抑制ConA刺激的T細胞活化及增殖; 其對增殖的抑制作用主要表現(xiàn)為S期的細胞的阻滯。 關(guān)鍵詞桑色素; T細胞活化; 增殖; 細胞周期桑色素(morin)化學名稱為(3,5,7,2,4五羥黃酮), 是黃酮類化合物中的一種, 為從黃桑木、 桑橙樹和許多中草藥中提取的一種淺黃色色素1。morin分子的結(jié)構(gòu)特點是含氧的雜環(huán)連接兩個芳香族環(huán), 具有抗炎、 抗腫瘤及抗氧化等作用。Fang等研究

11、表明, morin可抑制Th1細胞產(chǎn)生的IL12和經(jīng)LPS/IFN活化的巨噬細胞產(chǎn)生的NO, 提示morin具有抑制固有免疫的作用, 然而關(guān)于morin使T細胞活化、 增殖作用的研究, 國際、 國內(nèi)罕見報道。因此, 我們先用刀豆蛋白A(ConA)使T細胞活化、 增殖后, 再以morin進行刺激, 探討其對T細胞活化、 增殖的影響, 以為其臨床應用提供試驗依據(jù)。1  材料和方法1.1  材料  清潔級BALB/c近交系小鼠, 雄性, 68 周齡, 質(zhì)量(20±2) g, 購自廣東省實驗動物中心。morin、 ConA、 碘化丙錠(propidium iod

12、ide, PI)、 L谷氨酰胺、 巰基乙醇, 均購自美國Sigma公司。RPMI1640培養(yǎng)基、 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)為美國GibcoBRL公司產(chǎn)品。羧基熒光素雙醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimide ester, CFDASE)購自美國InvitrogenMolecular Probes公司。PE抗CD3單克隆抗體(mAb)及FITC抗CD69 mAb購自美國BDPharMingen公司。FACSCalibur流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。1.2  方法1

13、.2.1  小鼠淋巴細胞懸液的制備  將BALB/c小鼠斷髓處死, 無菌分離雙側(cè)腋窩、 鎖骨下、 腹股溝淺淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié), 置于盛有預冷的PBS的無菌平皿中, 去掉被膜, 通過200目尼龍網(wǎng)過濾。收集細胞, 加入到冷PBS中以250 g離心5 min, 洗滌細胞2次, 再懸于PBS中。1.2.2  T細胞早期活化標志CD69表達的檢測  采用直接免疫熒光標記法染色。設(shè)5個試驗組: 對照組(未加ConA和藥物刺激), ConA組,（ConA+morin 25 mol/L）組, （ConA+morin 50 mol/L）組, （ConA+morin 1

14、00 mol/L）組, 各組細胞培養(yǎng)6 h后, 取細胞懸液并離心濃縮至50 L, 加入濃度為0.2 mg/mL的PE抗小鼠CD3 mAb和FITC抗CD69 mAb各10 L, 混勻后, 室溫避光30 min。加入冷PBS中, 以250 g離心5 min, 再重懸于300 L的PBS中, 立即用流式細胞術(shù)進行檢測。1.2.3  T細胞增殖的CFDASE染色檢測  小鼠淋巴細胞按文獻的方法進行CFDASE染色, 將CFDASE用PBS稀釋成2 mol/L的工作液, 再以PBS調(diào)整細胞懸液的密度為2×1010/L, 加入等體積的CFDASE染液(終濃度為1mol/L)

15、, 充分混勻后, 在室溫條件下輕輕振蕩10 min。然后加入冷PBS中, 以250 g離心5 min, 洗滌細胞2次, 接種于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中, 并調(diào)整細胞的密度為2×109/L, 于37、 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。分別收獲培養(yǎng)48 h、 72 h的細胞, 加入濃度為0.2 mg/L的PE抗CD3 mAb, 離心洗滌細胞1次, 將細胞重懸于300 L的PBS中, 用流式細胞術(shù)進行檢測。1.2.4  細胞周期的分析  離心收獲培養(yǎng)48 h的細胞, 以700 mL/L乙醇固定后, 加入PI溶液(50 mg/L PI、

16、0.1% Triton X100、 0.1 mmol/L EDTA及50 mg/L RNase A)染色30 min, 然后用流式細胞術(shù)分析DNA的含量。1.2.5  流式細胞術(shù)分析  所有樣品經(jīng)FACSCalibur流式細胞儀和CELLQuest軟件獲取。先在前散射(FSC)對側(cè)散射(SSC)二維散點圖中, 劃出淋巴細胞區(qū)R1, 在橫坐標為PE抗CD3 mAb, 縱坐標為SSC的圖中, 劃出CD3+細胞區(qū)R2, 然后對淋巴細胞上的CD69FITC及CFDASE的熒光強度進行檢測。其中CFDASE、 FITC為熒光1(FL1), PE為熒光2(FL2)。每管細胞懸液樣品檢測

17、10000個細胞, 獲得的數(shù)據(jù)用CELLQuest及ModFit L T 3.2軟件進行分析。1.2.6  統(tǒng)計學處理  全部數(shù)據(jù)使用均Excel進行處理, 數(shù)據(jù)以x±s表示,   兩組間的比較采用配對t檢驗。2  結(jié)果2.1  Morin對T細胞CD69表達的影響  小鼠T細胞培養(yǎng)6 h后, ConA刺激組T細胞的活化率為(72.52±0.66)%與對照組(未經(jīng)ConA刺激的T細胞)T細胞的活化率(2.97±0.12)%相比較, 差異顯著 (P0.01)。于培養(yǎng)的T細胞中, 加入25 mol/

18、L、 50 mol/L、  100 mol/L的morin與ConA共孵育后, 均可明顯抑制ConA介導的CD69分子的表達, 其中, 100 mol/L的morin的抑制率最強, 檢測的T細胞中CD69+ T細胞的比率為(48.95±0.81)%, 與ConA組T細胞的活化率(72.52±0.66)%相比較差異顯著(P0.01, 圖1)。圖1  Morin對ConA激活的T細胞表面CD69分子表達的流式細胞術(shù)分析（略）Fig 1  Analysis of morin on CD69 expression on T cells activate

19、d with ConA by flow cytometry2.2  Morin對小鼠T細胞增殖的影響  CFDASE染色后, 在熒光1通道(FL1)中可檢測出均一染色的細胞群。根據(jù)細胞分裂1次, 其熒光強度倍減一半的原理, 動態(tài)追蹤了T細胞增殖的情況。用ModFit L T 3.2軟件擬合后, 得到增殖的T細胞各代的百分率及增殖指數(shù)(PI)。如圖2A、 2B所示, 細胞培養(yǎng)48及72 h后, ConA刺激組的細胞分別出現(xiàn)3、 4個子代峰,  加入25、 50及100 mol/L的morin后, 細胞分裂的代數(shù)及PI值均遞減(圖2C), 其中, 以100 mol/L

20、 morin加藥組的抑制作用最明顯, 培養(yǎng)48 h的T細胞的PI為(1.02±0.02), 培養(yǎng)72 h的T細胞的PI為(1.03±0.01)。與相應時點ConA刺激組T細胞的PI比較有統(tǒng)計學意義(P0.01, 圖2)。圖2  Morin對ConA刺激的T細胞增殖的影響（略）Fig 2  Effect of morin on proliferation of T cells stimulated with ConAA: Representative results for 48 h incubation; B: Representative result

21、s for 72 h incubation; C:  Statistic results of PI, aP0.01 vs ConA stimulation group (n=6, x±s).2.3  Morin 對小鼠T細胞周期的影響  未經(jīng)ConA刺激的對照組T細胞主要處于G0/G1期; 經(jīng)ConA刺激后48 h, 與對照組相比較, 處于S期和G2/M期細胞的比率明顯增加, 分別為(27.05±0.39)%和(15.93±0.75)%, 而各劑量的morin共孵育組其G2/M期T細胞的比率均明顯減少, 其中100 mol/L的mo

22、rin共孵育組T細胞的比率最少, 為(8.38±0.43)%; 25 mol/L及50 mol/L的morin共孵育組S期T細胞的比率明顯增加, 分別為 (30.90±0.59)%和(32.43±0.26)%, 與ConA組相比較具有統(tǒng)計學意義(P0.01, 表1)。表1  Morin對ConA刺激后培養(yǎng)48 h 的T細胞細胞周期的影響（略）Tab 1  The influence of morin on cellcycle of T cells stimulated with ConA for 48 haP0.05, bP0.01 vs Co

23、nA stimulation group.3  討論研究表明, morin可抑制LPS刺激的巨噬細胞的吞噬活性及IL12產(chǎn)生, 因此, morin對巨噬細胞吞噬活性和釋放IL12的抑制作用, 可能會下調(diào)T細胞介導的細胞免疫應答, 但morin是否直接影響T細胞的活化、 增殖有待闡明。本研究以ConA刺激T細胞活化、 增殖后, 用FCM檢測了T細胞早期活化標志CD69分子的表達和T細胞的增殖指數(shù)(PI)及各代細胞的百分率。研究結(jié)果顯示, 各濃度的morin對上述指標均有顯著地抑制作用, 提示其對T細胞活化的影響可能是通過抑制ConA與細胞膜表面TCR/CD3地交聯(lián)而激活早期活化相關(guān)的蛋

24、白酪氨酸激酶(PTK)Fyn和Lck的活性, 干擾了早期活化事件有關(guān)。另外, 也可能是由于對CD69等早期活化抗原表達的抑制而干擾了隨后的活化事件, 從而抑制了T細胞的增殖反應。本研究是體外試驗, 與Fang等的體內(nèi)試驗用藥方法(胃飼給藥)不同, 藥物濃度比Verbeek等所用的濃度相比較高, 所以有明顯的抑制效應。Morin具有抗菌、 抗腫瘤作用。Morin對金黃色葡萄球菌、 桿菌和黃色微球菌等都有抗菌作用10,   其抗菌機制主要表現(xiàn)為干擾細菌的DNA的合成11、 抑制細菌代謝相關(guān)的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性和復制型DNA解旋酶RepA的雙鏈DNA解旋活性12等。

25、Hsiang等1研究發(fā)現(xiàn), morin的抗腫瘤機制為誘導腫瘤細胞在S期中阻滯, 與本研究中morin對T細胞周期影響的結(jié)果類似, 提示其可能是通過抑制P38激酶途徑而干擾AP1活性, 使之不能發(fā)揮作用所致。此外, morin還可通過逆轉(zhuǎn)藥物外流運載體P糖蛋白(Pglycoprotein, Pgp)而引起多藥耐藥效應, 增加抗腫瘤藥物在過表達Pgp的腫瘤細胞內(nèi)蓄積而發(fā)揮抗腫瘤作用13。藥物發(fā)揮抗菌、 抗腫瘤的作用, 并不一定與適應性免疫必然相關(guān), 因此本研究的結(jié)論中得出的morin對T細胞活化、 增殖的抑制作用與其抗菌、 抗腫瘤作用并無矛盾。同種異基因移植排斥反應, 主要是受者的T細胞介導的移植

26、抗原特異性免疫應答。經(jīng)典的免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)是通過阻斷IL2依賴的T細胞生長和分化而發(fā)揮免疫抑制作用, 從而減輕排斥反應的程度, 延長移植物的存活時間。morin能抑制T細胞活化、 增殖, 并將其阻滯于S期, 提示其也是一種有效的免疫抑制劑, 有可能用于治療移植排斥反應。此外, Fang等的研究表明, morin與CsA可能在藥物代謝和藥效方面的相互作用而產(chǎn)生一種互補性效應, 即morin不改變被CsA抑制的Th1型免疫應答, 但可通過顯著減少組織中CsA的濃度而減輕CsA對正常組織的毒性作用, 提示在應用morin治療移植排斥方面具有光明的前景。morin能誘導腫瘤細胞在S期中阻

27、滯, 及逆轉(zhuǎn)Pgp引起多藥耐藥效應, 可以用來治療由于長期使用抗腫瘤藥物而發(fā)生耐藥現(xiàn)象的腫瘤患者, 或者是應用于器官移植術(shù)后的腫瘤病人有腫瘤復發(fā)的危險, 既需要使用免疫抑制劑抑制排斥反應又需要抗腫瘤治療時的情況。morin的免疫藥理機制值得進一步研究。 參考文獻:1 Hsiang CY, Wu SL, Ho TY. Morin inhibits 12Otetradecanoylphorbol13acetateinduced hepatocellular transformation via activator protein 1 signaling pathway and cell cycle

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29、al tumours to the flavonol, morin, during cancer progression: involvement of the Akt and stress kinase pathways？J. Carcinogenesis, 2003, 24(2): 171-177. Kitagawa S, Sakamoto H, Tano H. Inhibitory effects of flavonoids on free radicalinduced hemolysis and their oxidative effects on hemoglobinJ. Chem

30、Pharm Bull (Tokyo), 2004, 52(8): 999-1001. Fang SH, Hou YC, Chao PD. Pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions of morin and cyclosporineJ. Toxicol Appl Pharmacol, 2005, 205(1): 65-70. 肇靜嫻, 曾耀英, 何賢輝. 活體染料CFDASE在淋巴細胞增殖研究中的應用J. 細胞與分子免疫學雜志, 2003, 19(2): 109-111. Fulcher D, Wong S. Carboxyfluoresc

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33、emes S, Heinonen M, et al. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic compoundsJ. Int J Food Microbiol, 2000, 56(1): 3-12.11 Arima H, Ashida H, Danno G. Rutinenhanced antibacterial activities of flavonoids against Bacillus cereus and Salmonella enteritid

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35、roteinmediated transport?J. J Pharmacol Exp Ther, 2003, 304(3): 1258-1267.         2  結(jié)果2.1  Morin對T細胞CD69表達的影響  小鼠T細胞培養(yǎng)6 h后, ConA刺激組T細胞的活化率為(72.52±0.66)%與對照組(未經(jīng)ConA刺激的T細胞)T細胞的活化率(2.97±0.12)%相比較, 差異顯著 (P0.01)。于培養(yǎng)的T細胞中, 加入25 mol/L、 50 m

36、ol/L、  100 mol/L的morin與ConA共孵育后, 均可明顯抑制ConA介導的CD69分子的表達, 其中, 100 mol/L的morin的抑制率最強, 檢測的T細胞中CD69+ T細胞的比率為(48.95±0.81)%, 與ConA組T細胞的活化率(72.52±0.66)%相比較差異顯著(P0.01, 圖1)。圖1  Morin對ConA激活的T細胞表面CD69分子表達的流式細胞術(shù)分析（略）Fig 1  Analysis of morin on CD69 expression on T cells activated with

37、ConA by flow cytometry2.2  Morin對小鼠T細胞增殖的影響  CFDASE染色后, 在熒光1通道(FL1)中可檢測出均一染色的細胞群。根據(jù)細胞分裂1次, 其熒光強度倍減一半的原理, 動態(tài)追蹤了T細胞增殖的情況。用ModFit L T 3.2軟件擬合后, 得到增殖的T細胞各代的百分率及增殖指數(shù)(PI)。如圖2A、 2B所示, 細胞培養(yǎng)48及72 h后, ConA刺激組的細胞分別出現(xiàn)3、 4個子代峰,  加入25、 50及100 mol/L的morin后, 細胞分裂的代數(shù)及PI值均遞減(圖2C), 其中, 以100 mol/L morin加

38、藥組的抑制作用最明顯, 培養(yǎng)48 h的T細胞的PI為(1.02±0.02), 培養(yǎng)72 h的T細胞的PI為(1.03±0.01)。與相應時點ConA刺激組T細胞的PI比較有統(tǒng)計學意義(P0.01, 圖2)。圖2  Morin對ConA刺激的T細胞增殖的影響（略）Fig 2  Effect of morin on proliferation of T cells stimulated with ConAA: Representative results for 48 h incubation; B: Representative results for 7

39、2 h incubation; C:  Statistic results of PI, aP0.01 vs ConA stimulation group (n=6, x±s).2.3  Morin 對小鼠T細胞周期的影響  未經(jīng)ConA刺激的對照組T細胞主要處于G0/G1期; 經(jīng)ConA刺激后48 h, 與對照組相比較, 處于S期和G2/M期細胞的比率明顯增加, 分別為(27.05±0.39)%和(15.93±0.75)%, 而各劑量的morin共孵育組其G2/M期T細胞的比率均明顯減少, 其中100 mol/L的morin共孵育組

40、T細胞的比率最少, 為(8.38±0.43)%; 25 mol/L及50 mol/L的morin共孵育組S期T細胞的比率明顯增加, 分別為 (30.90±0.59)%和(32.43±0.26)%, 與ConA組相比較具有統(tǒng)計學意義(P0.01, 表1)。表1  Morin對ConA刺激后培養(yǎng)48 h 的T細胞細胞周期的影響（略）Tab 1  The influence of morin on cellcycle of T cells stimulated with ConA for 48 haP0.05, bP0.01 vs ConA stim

41、ulation group.3  討論研究表明, morin可抑制LPS刺激的巨噬細胞的吞噬活性及IL12產(chǎn)生, 因此, morin對巨噬細胞吞噬活性和釋放IL12的抑制作用, 可能會下調(diào)T細胞介導的細胞免疫應答, 但morin是否直接影響T細胞的活化、 增殖有待闡明。本研究以ConA刺激T細胞活化、 增殖后, 用FCM檢測了T細胞早期活化標志CD69分子的表達和T細胞的增殖指數(shù)(PI)及各代細胞的百分率。研究結(jié)果顯示, 各濃度的morin對上述指標均有顯著地抑制作用, 提示其對T細胞活化的影響可能是通過抑制ConA與細胞膜表面TCR/CD3地交聯(lián)而激活早期活化相關(guān)的蛋白酪氨酸激酶(

42、PTK)Fyn和Lck的活性, 干擾了早期活化事件有關(guān)。另外, 也可能是由于對CD69等早期活化抗原表達的抑制而干擾了隨后的活化事件, 從而抑制了T細胞的增殖反應。本研究是體外試驗, 與Fang等的體內(nèi)試驗用藥方法(胃飼給藥)不同, 藥物濃度比Verbeek等所用的濃度相比較高, 所以有明顯的抑制效應。Morin具有抗菌、 抗腫瘤作用。Morin對金黃色葡萄球菌、 桿菌和黃色微球菌等都有抗菌作用10,   其抗菌機制主要表現(xiàn)為干擾細菌的DNA的合成11、 抑制細菌代謝相關(guān)的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性和復制型DNA解旋酶RepA的雙鏈DNA解旋活性12等。Hsiang等1研究發(fā)現(xiàn), morin的抗腫瘤機制為誘導腫瘤細胞在S期中阻滯, 與本研究中morin對T細胞周期影響的