江浙蝮蛇毒誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

1、江浙蝮蛇毒誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究         09-09-20 16:21:00     編輯：studa20                        作者：胡玨 楊旭燕 呂慶華 許東航【關(guān)鍵詞】  江浙 蝮蛇毒 類(lèi)風(fēng)

2、濕性關(guān)節(jié)炎 滑膜細(xì)胞凋亡 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以滑膜增生、淋巴巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)滑膜層并伴有少量的凋亡為特征的自身免疫性疾病。既往研究表明抗凋亡蛋白Bcl-2在RA患者中較普通骨關(guān)節(jié)炎患者顯著上調(diào)，從而抑制滑液成纖維細(xì)胞的凋亡，并導(dǎo)致RA患者滑膜的超常增生，。 江浙蝮蛇毒（Agkistrodom halys Pallas venom，ASV）的主要活性成分蛇毒蛋白有誘導(dǎo)凋亡和抗腫瘤作用，臨床上已被用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性疾病所致的炎癥和疼痛，。然而，ASV對(duì)RA患者的治療作用機(jī)制尚未明確。作者自2007年2至7月檢測(cè)ASV對(duì)RA患者滑液成纖維細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。

3、60;   1  臨床資料    1.1  一般資料  選擇浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者6例，其中男3例，女3例；年齡3462歲，平均（50±10）歲；病程630年，平均（14±10）年。所有患者皆符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。    1.2  主要試劑  DMEM培養(yǎng)基、型膠原酶、FBS，美國(guó)Gibco公司；ASV由浙江龍圖蛇業(yè)集團(tuán)有限公司提供，-20 保存；Annexin V-FITC Apop

4、tosis Detection Kit，美國(guó)BD公司；鼠抗人bcl-2-FITC-mAb、羊-抗鼠-FITC-IgG-mAb，美國(guó)Caltag公司；碘化吡啶，美國(guó)Sigma公司。    1.3  滑膜細(xì)胞的分離和培養(yǎng)  無(wú)菌條件下，從關(guān)節(jié)置換術(shù)獲得的滑膜組織切成35 mm的碎片，用膠原酶和等體積的DMEM培養(yǎng)基，在37 、5%CO2孵箱中消化4 h。常規(guī)離心，棄上清液后加0.25 %胰酶1 ml，混勻后消化30 min。1000 r/min離心后棄上清液，加入含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，放至

5、37 、5 %CO2孵箱中孵育，常規(guī)傳代培養(yǎng)。    1.4  MTT法檢測(cè)ASV對(duì)RA滑膜細(xì)胞活力影響  調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為7×104/ml左右，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 l，培養(yǎng)24 h。加入不同質(zhì)量濃度的ASV（1.25、2.5、5、10 g/ml），以溶劑為陰性對(duì)照，再入培養(yǎng)箱于相同條件下培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 l MTT（5 mg/ml），在培養(yǎng)箱內(nèi)放置3 h，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)吸去上清液，加入150l DMSO，震蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm處測(cè)定各孔吸光度（A）值，記錄

6、結(jié)果，計(jì)算抑制率。    1.5  細(xì)胞凋亡檢測(cè)  采用流式細(xì)胞儀結(jié)合碘化丙啶（PI）和Annexin V-FITC雙標(biāo)記染色測(cè)定細(xì)胞凋亡率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2×105/ml。分組后加入不同質(zhì)量濃度的ASV（2.5、5、10g/ml），作用24、48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞2次，用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5l Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min，再加入5 l的20 g/ml的PI，混勻后室溫避光孵育5 min，在1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。

7、    1.6  細(xì)胞周期分析  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/ml，分組后加入不同質(zhì)量濃度的ASV（2.5、5、10 g/ml），作用24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，70 %冰乙醇固定，4 保存。上機(jī)測(cè)定前，離心去乙醇，用PBS洗滌2次。加入500 l PI （50 g/ml），4 避光染色30 min，用200 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。    1.7  Bcl-2蛋白表達(dá)分析  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/ml，分組后加入不

8、同質(zhì)量濃度的ASV（2.5、5、10 g/ml），作用24 h后，用含70%乙醇的PBS 1ml滲透細(xì)胞30 min，沖洗2 次，棄上清液。加FITC標(biāo)記的bcl-2單抗（150）100l，4 下孵育30 min，PBS洗2次。加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1200）100 l，4 下孵育30 min ，PBS洗2次。用PBS代替單抗作陰性對(duì)照，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，bcl-2蛋白表達(dá)水平以陽(yáng)性細(xì)胞百分率表示。    1.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來(lái)自至少3組平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)用(x±s)表示。組間差異性比較采用SPSS10.0

9、軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05有顯著性差異。    2  結(jié)果    2.1  ASV對(duì)細(xì)胞增殖的影響  MTT比色結(jié)果顯示，不同濃度的ASV對(duì)體外生長(zhǎng)的成纖維樣滑膜細(xì)胞有增殖抑制作用。經(jīng)1.25 g/ml ASV處理的細(xì)胞生長(zhǎng)受到輕微抑制，在ASV2.510 g/ml范圍內(nèi)，抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性，與對(duì)照組比較，細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。據(jù)此，選擇2.5、5、10 g/ml作為以下實(shí)驗(yàn)ASV的作用濃度。見(jiàn)圖1。    圖1 

10、 ASV對(duì)細(xì)胞增殖的影響    2.2  流式細(xì)胞儀檢測(cè)滑膜細(xì)胞凋亡率  流式細(xì)胞儀檢測(cè)滑膜細(xì)胞凋亡結(jié)果表明滑膜細(xì)胞加藥處理后凋亡細(xì)胞百分率明顯高于未加藥組（P<0.05）。當(dāng)ASV濃度為5 g/ml和10 g/ml時(shí)，24 h后與對(duì)照組相比凋亡百分率出現(xiàn)顯著增加。并隨時(shí)間的延長(zhǎng)及藥物濃度的增高，凋亡細(xì)胞數(shù)增加。見(jiàn)表1。 表1  不同濃度ASV對(duì)RA滑膜細(xì)胞凋亡率的影響（%）注：與正常對(duì)照組比較P<0.05，*P<0.01    2.3  流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化 

11、; 不同濃度的ASV對(duì)RA滑膜細(xì)胞作用48 h，其細(xì)胞周期的分析結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明G0/G1期的細(xì)胞百分比逐漸增加，S期細(xì)胞百分比無(wú)明顯變化，G2/M期比例明顯減少（P<0.05或0.01）。說(shuō)明ASV的作用在G1S期，并能阻滯G1期細(xì)胞向S期移行，造成G1期細(xì)胞堆積，阻滯DNA合成和復(fù)制，抑制滑膜細(xì)胞周期進(jìn)程。表2  不同濃度ASV作用HFLS-RA 24 h對(duì)細(xì)胞周期的影響（%） 注：各實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組比較*P<0.05，*P<0.01    2.4  流式細(xì)胞儀檢測(cè)bcl-2蛋白的表達(dá)  離心收集經(jīng)不同

12、濃度ASV處理的RA滑膜細(xì)胞，以FITC標(biāo)記的bcl-2單抗與細(xì)胞共同孵育后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，2.5 g/ml ASV組的bcl-2蛋白表達(dá)差異不明顯，5     g/ml，10 g/ml ASV組隨藥物濃度的增加而bcl-2蛋白表達(dá)下降（P<0.05或0.01）。見(jiàn)表3。表3  不同濃度ASV作用HFLS-RA對(duì)Bcl-2蛋白的表達(dá) 注：各實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組比較*P<0.05，*P<0.01     09-09-20 16:21:00   &

13、#160; 編輯：studa20    3  討論     類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatiod arthritis，RA)成纖維樣滑膜細(xì)胞(HFLS)是關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中主要的一種,可釋放多種細(xì)胞因子，并可因環(huán)境變化發(fā)生演變，存在異常凋亡與增殖。RA-HFLS凋亡不足與RA的發(fā)病有關(guān)。因此，促進(jìn)引起自身免疫反應(yīng)的細(xì)胞凋亡，就有可能成為治療此類(lèi)疾病的一個(gè)新途徑。    文獻(xiàn)資料表明，蛇毒含神經(jīng)毒、細(xì)胞毒、眼鏡蛇毒因子、抗凝血因子、膽堿酯酶等多種活性成分，并富含鋅、鎂等微量元素，藥理作用非常

14、廣泛，有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)RA患者有很好的治療效果，治療后患者類(lèi)風(fēng)濕因子等有關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)轉(zhuǎn)陰率較高，復(fù)發(fā)率低，預(yù)后良好，特別是能明顯改變部分晚期RA患者的關(guān)節(jié)活動(dòng)功能，而且無(wú)明顯毒副作用。蛇毒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方面得到明確證實(shí)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，眼鏡蛇毒素對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的踝關(guān)節(jié)腫脹程度影響不大，但可顯著抑制大鼠棉球樣肉芽腫形成，提示眼鏡蛇毒素抗RA作用可能主要是對(duì)關(guān)節(jié)滑膜增生過(guò)程有一定保護(hù)或逆轉(zhuǎn)作用。Dong等研究表明江浙蝮蛇毒(ASV)作用于人白血病Jurkat細(xì)胞后，可見(jiàn)ASV具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒作用48hIC50值為（9.78±0.38）g/ml，并

15、能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而對(duì)于ASV引起HFLS凋亡的機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。    本研究采用MTT法觀察ASV對(duì)RA患者體外培養(yǎng)的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)ASV能抑制其增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。在此基礎(chǔ)上，作者應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化結(jié)果顯示，ASV能阻滯G1期細(xì)胞向S期移行，導(dǎo)致G1期細(xì)胞堆積，阻滯DNA合成和復(fù)制，提示可能與抑制細(xì)胞周期蛋白磷酸化的G1/S關(guān)卡有關(guān)。以上研究表明，ASV呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性地抑制滑膜細(xì)胞增殖的作用。這與許多研究表明的蛇毒可抑制腫瘤細(xì)胞等增殖的結(jié)果大致相同，。    在RA滑膜細(xì)胞

16、凋亡相關(guān)的分子中，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中一對(duì)凋亡相關(guān)基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起重要作用，Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2作為原癌基因阻止細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)，RA患者滑膜淋巴細(xì)胞T細(xì)胞大量bcl-2表達(dá)且無(wú)凋亡現(xiàn)象，提示bcl-2表達(dá)提供給炎癥細(xì)胞生存信號(hào)。Bcl-2過(guò)量表達(dá)可能抑制RA滑膜細(xì)胞凋亡，是RA滑膜增生的原因之一。RA患者滑膜細(xì)胞上bcl-2表達(dá)上調(diào)，可活化凋亡抑制信號(hào)，從而促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增生和增殖。對(duì)滑膜細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究，為RA多靶點(diǎn)治療提供了可能。本研究中，ASV誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡時(shí)伴有bcl-2蛋白表達(dá)下降。在5、10 g/ml濃度范圍內(nèi)，bcl-2蛋白的表達(dá)隨著

17、ASV濃度的增加而降低。這說(shuō)明bcl-2在ASV體外誘導(dǎo)RA患者滑膜成纖維細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中有重要作用，但其如何調(diào)控基因表達(dá)，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。【參考文獻(xiàn)】  1 Ceponis A，Hietanen J，Tamulaitiene M，et al. A comparative quantitative morphometric study of cell apoptosis in synovial membranes in psoriatic， reactive and rheumatoid arthritis. Rheumatology，1999，38：431440.2 Perlma

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