氯沙坦干預(yù)病毒性心肌炎恢復(fù)期、慢性期心臟膠原表達(dá)及心功能的實(shí)

1、    氯沙坦干預(yù)病毒性心肌炎恢復(fù)期、慢性期 心臟膠原表達(dá)及心功能的實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】目的觀察病毒性心肌炎恢復(fù)期、慢性期心臟間質(zhì)膠原表達(dá)及其對(duì)心功能的影響，并初步探討藥物干預(yù)的效果，為臨床干預(yù)心肌纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法建立恢復(fù)期、慢性期病毒性心肌炎小鼠模型，通過(guò)阻抗微分法觀察心排血量，H.E.染色及苦味酸天狼猩紅膠原特異染色偏振光顯像進(jìn)行心臟間質(zhì)膠原的組織化學(xué)觀察，RT-PCR觀察心臟I型膠原mRNA表達(dá)的變化，并與氯沙坦(losartan)干預(yù)后比

2、較。結(jié)果病毒性心肌炎恢復(fù)期心臟膠原增生，心排血量降低，氯沙坦干預(yù)后膠原表達(dá)無(wú)論從蛋白水平還是從mRNA水平均明顯降低，但心排血量未見明顯改善；病毒性心肌炎慢性期心臟膠原大量增生，心排血量降低，氯沙坦干預(yù)后膠原表達(dá)無(wú)論從蛋白水平還是從mRNA水平均明顯降低，心排血量改善，與正常對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性。結(jié)論病毒性心肌炎恢復(fù)期可能存在修復(fù)性纖維化和反應(yīng)性纖維化兩種膠原增生狀態(tài)，二者對(duì)心功能的影響不同，這可能是氯沙坦消除增生的膠原后心臟功能不見明顯改善的原因。病毒性心肌炎慢性期膠原蛋白增生為單純性反應(yīng)性纖維化，使心排血量下降，氯沙坦部分阻逆反應(yīng)性增生膠原，可提高心排血量，改善心臟功能。【關(guān)鍵詞】氯沙坦

3、心肌炎膠原心臟功能試驗(yàn) Expression of myocardial collagen and cardiac function in recovery and chronic stage of viral myocarditis: Losartan intervention study JING Zhicheng*, CHENG Xiansheng, YANG Yingzhen. *Division of Cardio-pulmonary Circulation, Fu Wai Hospital, PUMC & CAMS, Beijing 100037【Abstract】Obje

4、ctiveTo investigate the remodeling of myocardial interstitial collagen in mice with viral myocarditis (VMC) at revovery and chronic stage and its effects of cardiac function, preliminarily probe the feasibility of drug intervention, offer the experimental evidence for clinic to intervene the fibrosi

5、s of heart interstitium.MethodsThe mice model with VMC was established. CO was measured by impedance differential plethysmography, myocardial interstitial collagen was observed by staining with H.E. and Sirius Red in a supersaturated picric acid solution viewed by polarization microscopy. The change

6、s of mRNA expression of collagen type I were analyzed by RT-PCR. The results were compared with those after intervention with Losartan.ResultsMyocardial collagen proliferated significantly and CO decreaed in two stages of VMC, and the expression of collagen mRNA and protein decreased remarkably afte

7、r intervention with Losartan. In chronic stage, CO was improved after intervention with Losartan and there was no significant difference compared with normal control, but after intervention in recovery stage, CO was no significant difference compared with VMC that without intervening markably, CO im

8、proved. ConclusionAt recovery stage, there could be two kinds of fibrosis course: reparative fibrosis and reactive fibrosis, the effect of these two courses may offset each other, this may be the reason why no influnence of cardiac index was observed. At chronic stage, collagen increased widely whic

9、h is the result of reactive fibrosis, the proliferous collagen impaired greatly the cardiac function. Intervening by Losartan could improve cardiac function through suppressing reactive fibrosis during chronic phase of viral myocarditis. 【Key words】losartan myocarditiscollagenheart function tests尸檢或

10、心內(nèi)膜心肌活檢證實(shí),病毒性心肌炎慢性期主要病理解剖特點(diǎn)為心臟間質(zhì)纖維化，但此點(diǎn)是否是患者心功能障礙的原因，尚不清楚。型、型膠原是心臟間質(zhì)的重要成分，其中由型膠原為主組成的粗纖維較為強(qiáng)硬，含量稍增即影響心臟順應(yīng)性1，2?，F(xiàn)已知病毒性心肌炎急性期膠原增生已經(jīng)啟動(dòng)，但其作用是對(duì)壞死心肌的修復(fù)，即修復(fù)性纖維化3。因此，觀察病毒性心肌炎恢復(fù)期及慢性期心臟膠原表達(dá)及其對(duì)心功能影響的規(guī)律，可以幫助我們?nèi)媪私獠《拘孕募⊙仔募￠g質(zhì)的病理變化過(guò)程，為臨床治療病毒性心肌炎慢性期心肌纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。大量資料證實(shí)，血管緊張素受體拮抗劑可明顯抑制心臟間質(zhì)膠原的合成過(guò)程，我們應(yīng)用其代表性藥物氯沙坦(losartan)

11、對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行了初步的探討。材料與方法一、動(dòng)物模型的制作5周齡雄性Balb/c小鼠，腹腔接種柯薩奇B3病毒（CVB3）1×103 PFU 0.4 ml后，隨機(jī)分為兩大組。第一組為病毒性心肌炎恢復(fù)期動(dòng)物，接種病毒后至12天隨機(jī)分為A組(n=18)、B組(n=28),另設(shè)腹腔接種不含病毒的Eagles液后常規(guī)飼養(yǎng)的正常小鼠為C組(n=10)；其中B組經(jīng)口飼氯沙坦10mg.kg-1.day-14，A、B兩組均用高蛋白飼料喂養(yǎng)；藥物干預(yù)18天后，A組死亡11只，B組死亡16只，C組沒有死亡。第二組接種病毒后30天，作為病毒性心肌炎慢性期動(dòng)物隨機(jī)分為D組(n=10)和E組(n=10),腹腔接種不

12、含病毒的Eagles液后常規(guī)飼養(yǎng)的正常小鼠為F組(n=7);其中E組管飼氯沙坦，劑量同B組；30天后，D組死亡5只，E組死亡2只，F(xiàn)組沒有死亡。將存活小鼠稱重后進(jìn)行以下處理。二、心排血量的測(cè)定用阻抗微分法對(duì)所有小鼠心排血量進(jìn)行測(cè)定5，并計(jì)算心指數(shù)。三、心肌標(biāo)本的采集及處理心排血量測(cè)定后立即開胸取出心臟，濾紙吸干稱重后沿左室長(zhǎng)軸剪為兩份。一份立即放入液氮冷凍保存,以備RNA的提取；另一份立即放入10%的中性福爾馬林液,固定24小時(shí)后行組織化學(xué)處理。四、組織化學(xué)檢查將組織按常規(guī)沖洗，不同濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋，切片（厚度5 m），常規(guī)H.E.染色，苦味酸天狼猩紅膠原特異染色6。所

13、用試劑除特殊說(shuō)明外，均購(gòu)自北京天象人生物技術(shù)有限公司。組織化學(xué)照片均用Pharmacia 公司的Ultro Scan LX JI激光密度掃描儀進(jìn)行掃描，掃描面積積分半定量分析。五、RT-PCR按照硫氰酸胍法提取心臟組織的總RNA，型膠原引物和GAPDH引物同時(shí)加入，PCR反應(yīng)模板為2 l，RT-PCR常規(guī)進(jìn)行,反應(yīng)條件為:94、30秒，55、40秒，72、50秒，重復(fù)上述三步驟共30次循環(huán)。4放置或儲(chǔ)存于-20。取PCR產(chǎn)物510 l，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，照相。型膠原、GAPDH的PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別為245 bp、196 bp。所有照片均用Pharmacia 公司的Ultro Scan

14、 LX JI激光密度掃描儀進(jìn)行掃描，掃描面積積分半定量分析。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果1.病毒性心肌炎恢復(fù)期B組與A組相比,病死率（FR）稍減低，存活小鼠心排血量(CO)及心臟指數(shù)(CI)未見明顯改善，二者均明顯低于正常對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性(表1)。表1恢復(fù)期三組小鼠之間CO、CI、FR的比較（±s）組別CO（ml/min）CI（10-2ml.min-1.cm-2）FR(%)A組（7只）1.17±0.05*1.91±0.18*61.1B組（12只）1.16&

15、#177;0.11*1.97±0.25*57.1C組（10只）1.67±0.082.44±0.180注：?與C組相比，P<0.0012.病毒性心肌炎慢性期E組與D組相比，F(xiàn)R明顯減低，存活小鼠CO及CI明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性（表2）。表2慢性期三組小鼠之間CO、CI、FR的比較（±s）組別CO（ml/min）CI（10-2ml.min-1.cm-2）FR(%)D組（5只）1.39±0.21*2.07±0.30*50E組（8只）1.86±0.092.57±0.1520F組（7只）1.99±0

16、.032.75±0.120注：?與E組、F組相比，P<0.0013.病理學(xué)及組織化學(xué)檢查：病毒性心肌炎恢復(fù)期小鼠心肌仍可見壞死灶，但炎性浸潤(rùn)逐漸吸收，可見散在淋巴、單核細(xì)胞,間質(zhì)內(nèi)已經(jīng)有較多的膠原纖維；藥物干預(yù)組基本與心肌炎組相同，只是間質(zhì)內(nèi)罕見膠原纖維?？辔端崽炖切杉t膠原特異染色偏振光顯像：病毒性心肌炎恢復(fù)期小鼠心臟間質(zhì)可見膠原增生，主要是I型膠原；膠原增生有束狀排列（間質(zhì)處）和團(tuán)塊狀（病灶處）兩種形態(tài)；而藥物干預(yù)組小鼠心臟間質(zhì)膠原表達(dá)明顯降低。掃描積分分析結(jié)果：B組為3.46±1.50 AU*mm,明顯低于A組（7.49±1.20 AU*mm），P<

17、;0.01；與C組（2.96±0.95 AU*mm)比，差異無(wú)顯著性。病毒性心肌炎慢性期小鼠心臟間質(zhì)型及型膠原可見大量增生，而藥物干預(yù)組小鼠心臟間質(zhì)膠原表達(dá)明顯降低。掃描積分分析結(jié)果：E組為2.59±0.49 AU*mm,明顯低于D組(8.44±3.30 AU*mm),P<0.01 ;與F組(2.83±0.52 AU*mm)相比, 差異無(wú)顯著性。4.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：病毒性心肌炎恢復(fù)期A組小鼠心肌I型膠原mRNA表達(dá)明顯高于B、C兩組, B、C兩組差異無(wú)顯著性（1）。半定量掃描結(jié)果：A組為2.61,B組為1.90，C組為1.67。病毒性心肌炎慢

18、性期D組小鼠心肌I型膠原mRNA表達(dá)明顯高于E、F兩組, E、F兩組差異無(wú)顯著性（2）。半定量掃描結(jié)果：D組為1.95, E、F兩組分別為0.85和0.66。1病毒性心肌炎恢復(fù)期A組小鼠心肌型膠原mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，B組與C組差異無(wú)顯著性(注：對(duì)照為pBR 322/Hinf I，2同此)2病毒性心肌炎慢性期D組小鼠心肌型膠原mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，E組與F組差異無(wú)顯著性 討論心臟間質(zhì)膠原網(wǎng)絡(luò)在心臟血管疾病的研究中逐漸受到重視，膠原代謝與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系，國(guó)內(nèi)外已多有報(bào)道。許多資料表明，心肌膠原病理性增生可嚴(yán)重影響心肌順應(yīng)性，使心功能下降7?？刂菩呐K間質(zhì)膠原的代謝，在心臟血

19、管疾病的防治中具有重要意義。從病理學(xué)角度來(lái)講，膠原增生分兩種過(guò)程：修復(fù)性纖維化和反應(yīng)性纖維化。作者曾報(bào)道，在病毒性心肌炎急性期阻斷心肌膠原增生不利于心功能改善，提示病毒性心肌炎急性期膠原增生屬修復(fù)性纖維化過(guò)程，有利于穩(wěn)定心功能3。這與本研究結(jié)果有所不同。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，因病毒性心肌炎的急性期與恢復(fù)期、慢性期膠原增生的機(jī)制及性質(zhì)不同，故急性期和恢復(fù)期、慢性期膠原增生對(duì)心臟功能的影響也就各有特點(diǎn)。在病毒性心肌炎恢復(fù)期，氯沙坦干預(yù)使心臟膠原表達(dá)明顯降低,但心臟指數(shù)在干預(yù)組與非干預(yù)組小鼠差異無(wú)顯著性。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，在病毒性心肌炎恢復(fù)期仍有心肌壞死灶，組織化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)在心肌壞死區(qū)和非心肌壞死區(qū)都可

20、見到膠原增生，增生范圍明顯大于急性期，提示此時(shí)修復(fù)性纖維化與反應(yīng)性纖維化對(duì)心肌功能作用正好相反的病理學(xué)過(guò)程并存，這與Silver等8的研究結(jié)果相近。氯沙坦干預(yù)雖可消除反應(yīng)性纖維化對(duì)心功能的負(fù)面影響,但同時(shí)也阻斷了修復(fù)性纖維化過(guò)程對(duì)心功能的正面作用,這可能是氯沙坦干預(yù)結(jié)果的原因。另外，從研究結(jié)果來(lái)看，病毒性心肌炎慢性期，氯沙坦干預(yù)后，小鼠心肌膠原表達(dá)無(wú)論從蛋白水平還是mRNA水平都下降，臨床表現(xiàn)為病死率下降，存活小鼠心功能明顯改善，提示膠原增生即心肌纖維化在病毒性心肌炎慢性期是影響心臟功能的一項(xiàng)原因。結(jié)果提示，在心肌炎慢性期用藥物消除慢性心肌炎患者的心肌纖維化確可改善病情，有利于預(yù)后。結(jié)合已發(fā)表

21、的資料可以看出,病毒性心肌炎急性期炎癥引起的組織壞死可能啟動(dòng)了心肌膠原增生過(guò)程,隨著組織的自身修復(fù),纖維化的性質(zhì)發(fā)生了變化,從急性期到恢復(fù)期、慢性期可以描述為:修復(fù)性纖維化發(fā)展為修復(fù)性纖維化+反應(yīng)性纖維化、再發(fā)展為反應(yīng)性纖維化這樣一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。而在病毒性心肌炎的恢復(fù)期干預(yù)心肌纖維化是否有利尚難肯定，有待進(jìn)一步研究。目前已知，在高血壓性左室肥厚心肌內(nèi)型膠原表達(dá)增加，可使心臟順應(yīng)性下降，僵硬度增加，進(jìn)而引起心臟功能障礙1。但這是否也是慢性心肌炎心功能不全的原因，尚不清楚。但病毒性心肌炎慢性期心肌纖維化的特點(diǎn)和作用與急性期有所不同，病理學(xué)檢查證實(shí)，在慢性期已無(wú)心肌壞死灶，其主要病理學(xué)特征為心臟間質(zhì)纖

22、維化，即間質(zhì)膠原網(wǎng)絡(luò)中型、型膠原增生性重建，這在本研究的組織化學(xué)研究中已得到證實(shí)。而本研究的RT-PCR結(jié)果也表明,膠原表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平已經(jīng)增高，提示此時(shí)增生的膠原是對(duì)慢性炎癥的反應(yīng)性增生，病理學(xué)意義應(yīng)該與高血壓左室肥厚的膠原增生機(jī)制類同，是反應(yīng)性纖維化。增生的膠原降低心肌順應(yīng)性，引起心功能障礙，所以氯沙坦 干預(yù)可改善心功能。作者單位：100037 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 阜外心血管病醫(yī)院心臟肺循環(huán)研究室（荊志成、程顯聲）；上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院衛(wèi)生部病毒性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（楊英珍）參考文獻(xiàn)1Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease:the fibriller collagen network. J Am Coll Cardiol, 1989,13:1637-1652.2荊志成,程顯聲.心臟膠原網(wǎng)絡(luò)及其病理學(xué)意義.中國(guó)循環(huán)雜志, 1998,13: 187-188.3荊志成,程顯聲,楊英珍,等.病毒性心肌炎急性期預(yù)防性干預(yù)心臟間質(zhì)纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.中華醫(yī)學(xué)雜志,1998,78:699-701.4Atsuo Tnaka,Akira Matsumori, Wang Weizhong, et al.Angiotension II