脂質(zhì)體-腺相關(guān)病毒質(zhì)粒復合物介導基因聯(lián)合抗小鼠肝癌的研究

1、    脂質(zhì)體-腺相關(guān)病毒質(zhì)粒復合物介導基因 聯(lián)合抗小鼠肝癌的研究        目前肝癌主要采用手術(shù)、放療、化療和局部治療為主的綜合療法，但治療效果多不滿意，有必要探索新的治療方法。IL-2和IFN-是目前研究較多、療效較為肯定的2個腫瘤基因治療用細胞因子基因，并已應(yīng)用于臨床。由于IL-2和IFN-在誘導抗瘤免疫反應(yīng)中的互補性，因此聯(lián)合應(yīng)用這兩種因子基因可望提高抗瘤效果1。我們利用內(nèi)含子和腺相關(guān)病毒調(diào)控片段構(gòu)建了增強的真核質(zhì)粒表達載體，通過較簡單的陽離子脂質(zhì)體介導

2、轉(zhuǎn)染肝癌細胞，觀察了其表達情況、免疫反應(yīng)及抗瘤效應(yīng)。 材料與方法主要試劑、質(zhì)粒、細胞株及動物：Dosper、無血清培養(yǎng)基，非同位素雜交試劑盒及-gal單抗購自Boerhinger公司。Lipofectin及RNA抽提試劑盒為GIBCO BRL公司產(chǎn)品。標準品rIL-2及mIFN-為Sigma公司產(chǎn)品。從pC53-SN3切取的CMVp片段替代腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAP中的AP片段后得pAC。分別自pGCEN-hIL-2及pBIuescript SK+/-mIFN-切取hIL-2 cDNA及mIFN- cDNA，然后分別插入到pAC中CMVp下游，最后自pAd-CMV-Link中切取intron A，插

3、入CMVp與hIL-2或mIFN-之間得pAI-hIL-2及pAI-mIFN-。小鼠肝癌細胞MM45T.Li由第二軍醫(yī)大學曹廣文教授惠贈。CTLL及L929細胞為本室傳代保存。BALB/c小鼠，雌性，體重2022g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。體外細胞轉(zhuǎn)染：24孔板中，每孔種3×104 MM45T.Li細胞，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染。Dosper-DNA復合物制備方法：0.9g DNA，3.6l Dosper分別稀釋于50l無血清培養(yǎng)基中，輕混后并兩液，混勻后室溫置1545min即形成復合物。Lipofectin-DNA復合物制備時取0.9g DNA和1.8l Lipofectin

4、。無血清培養(yǎng)基洗滌后，加400l無血清培養(yǎng)基并滴加復合物，培養(yǎng)12h后去復合物，換成含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。X-gal及免疫組化染色：轉(zhuǎn)染48h后，先按常規(guī)行X-gal染色，37染24h后再按常規(guī)作-gal免疫組化染色，鏡下計數(shù)陽性細胞。IL-2及IFN-生物活性測定：采用改良MTT法。用IL-2依賴的CTLL測IL-2活性。用L929的細胞毒性試驗測IFN-活性。Northern印跡分析：用DIG high primer DNA標記試劑盒標記472bp的IL-2 cDNA和465bp的IFN- cDNA。30g RNA經(jīng)1.1%甲醛變性膠電泳后轉(zhuǎn)移至Hybond尼龍

5、膜上，采用DIG DNA標記系統(tǒng)進行雜交(按說明書操作)。荷瘤小鼠的治療觀察：于每只小鼠左腋皮下注射5×105 MM45T.Li細胞，待腫瘤長至平均直徑6.06.2mm時進行治療。隨機分4組，每組10只，每只瘤內(nèi)多點注射100l脂質(zhì)體-DNA復合物，內(nèi)含10g DNA及40l Dosper。每隔48h注射1次。連續(xù)注射3次，定期觀察腫瘤生長情況。小鼠脾細胞CTL活性：最后1次瘤內(nèi)注射復合物后14d取小鼠脾臟，體外制成脾細胞懸液，與60Co照射的MM45T.Li細胞共培養(yǎng)5d，培養(yǎng)液中加50U/ml IL-2，采用5h 51Cr釋放法檢測CTL對MM45T.Li的殺傷活性。結(jié)果及討論陽

6、離子脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)移具有安全性好、簡便易行等優(yōu)點，但轉(zhuǎn)導效率較低2。為提高其效率，需要改進真核質(zhì)粒表達載體及陽離子脂質(zhì)體。啟動子與治療基因間插入內(nèi)含子也可提高基因表達水平3，因此，我們用AAV-ITRs和內(nèi)含子A構(gòu)建真核質(zhì)粒表達載體，并通過陽離子脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)移治療基因。從實驗結(jié)果看，Lipofectin和新型陽離子脂質(zhì)體Dosper均有較好的抵抗血清抑制的作用，且Dosper轉(zhuǎn)染效率明顯優(yōu)于Lipofectin。因此，我們用Dosper介導體內(nèi)轉(zhuǎn)移IL-2及IFN-基因。體外短暫轉(zhuǎn)染MM45T.Li后，48h取培養(yǎng)上清測IL-2及IFN-活性。轉(zhuǎn)染后測得上清IL-2活性48h為208IU/m

7、l，IFN-活性48h為1625IU/ml。皮下肝癌模型上，直接瘤內(nèi)注射Dosper-DNA復合物，最后1次瘤內(nèi)注射復合物48h取瘤組織并抽提總RNA。取30g RNA作Northern分析，分別用IFN-探針及IL-2探針可檢測到IL-2及IFN-表達。與對照組相比，單注射IL-2或IFN-基因復合物能抑制腫瘤生長，且IL-2組優(yōu)于IFN-組，聯(lián)合注射IL-2及IFN-基因產(chǎn)生更大的抑制作用。小鼠脾細胞體外與滅活的MM45T.Li共培養(yǎng)后進行CTL活性檢測，IL-2基因組高于IFN-基因組，聯(lián)合注射2種基因誘導作用更強(1)。然而，抑瘤效果持續(xù)時間較短，這可能與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)基因表達時間較短有關(guān)。

8、說明，應(yīng)用此治療方法需要多次治療才能達到較長期效果。我們還發(fā)現(xiàn)，以LacZ作為報告基因，通過X-gal染色及免疫組化評估轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，免疫組化陽性率明顯高于X-gal染色，提示傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)導表達效率判斷方法X-gal染色，低估了實際轉(zhuǎn)導表達效率，而用-gal抗體作的免疫組化卻能更好地反映轉(zhuǎn)基因效率。其原因是：X-gal染色檢測的是表達-gal生物活性，而活性發(fā)揮受許多因素影響，故敏感性差；而用-gal抗體，則是與-gal抗原決定簇結(jié)合，主要檢測表達的-gal的存在性，故陽性率更高。1注射脂質(zhì)體-DNA復合物后小鼠脾細胞CTL活性Fig 1. Generation of specific sp

9、lenic CTL activitya. pAC-LacZ; b. pAI-hIL-2; c. pAI-mIFN-; d. pAI-hIL-2+pAI-mIFN-基金項目：國家自然科學基金資助項目(39730440)作者單位：張景迎（上海第二醫(yī)科大學人類基因治療研究中心）魏道嚴（上海第二醫(yī)科大學人類基因治療研究中心）陳詩書（上海第二醫(yī)科大學人類基因治療研究中心）參考文獻1Rosenthal FM, Cronin K, Bannerji R, et al. Augmentation of antitumor immunity by tumor cells transduced with a retroviral vector carrying the interleukin-2 and interferin- cDNAs. Blood, 1994, 83:1289-1298.2張景迎, 夏愛娣, 陳詩書. 陽離子脂質(zhì)體用作基因轉(zhuǎn)移載體的研究進展. 國外醫(yī)學預防、診斷、治療用生物制品分冊, 1997, 20:156-160.3Vieweg J, Boczkowski D, Roberson KM, et al. Dfficient gene