微生物限度檢查法操作規(guī)程

1、定義微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。 本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為 3035；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為 2328。 檢驗(yàn)結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2為單位報(bào)告，特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。 檢查環(huán)境 微生物限度檢查環(huán)境在潔凈度C級(jí)下的局部潔凈度B級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。微生物限度檢查室 要求 溫度：1826； 相對(duì)濕度：4565； 壓差：潔凈室與外界壓差30Pa 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基、 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)

2、養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基 稀釋液和沖洗液 0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 0.9%氯化鈉溶液 供試品的保存 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死或繁殖。 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 以頭孢氨芐膠囊為例 1.在潔凈室使用記錄上登記好頭孢氨芐膠囊的規(guī)格、批號(hào)；準(zhǔn)備一張微生物限度檢查空白記錄，填好除檢驗(yàn)結(jié)果以及溫濕度外的其他必要信息。 2.準(zhǔn)備好相應(yīng)的檢查用品： 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅納瓊脂培養(yǎng)基各1瓶融化后，放入烤箱中待用 10

3、0mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1瓶 9ml/管的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液4支 0.1%蛋白胨水溶液（500ml瓶） 濾杯 沉降菌平皿 空白平皿-吸管、鑷子、剪刀等放入不銹鋼盒中經(jīng)干熱滅菌后待用 3.配置消毒液 0.1%潔爾滅溶液 75%乙醇傳遞窗物料微生物限度檢查室注注：進(jìn)入無菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層包裝的，需將外包裝在傳遞窗或緩沖間拆除后，經(jīng)傳遞窗傳入實(shí)驗(yàn)室。4.將待檢樣品以及的相關(guān)用品（包括培養(yǎng)基、緩沖液以及檢測(cè)用器皿等），經(jīng)傳遞窗紫外消毒60分鐘后，再轉(zhuǎn)運(yùn)至微生物限度檢查室。 5.按空調(diào)機(jī)組上的F2”鍵，開啟空調(diào)；通過物流通道處的按鈕，開啟凈化工作臺(tái)。 化驗(yàn)人員按照進(jìn)出微生物

4、檢測(cè)室更衣操作規(guī)程進(jìn)行正確的更衣。 進(jìn)入更鞋室更鞋脫去工作服及私人衣物（只剩貼身內(nèi)衣、內(nèi)褲）掛在衣鉤上并將所有頭發(fā)塞入發(fā)網(wǎng)中固定洗手用手肘開門進(jìn)入一更。 然后取GEL溶液23ml，采用六步法對(duì)雙手和手腕進(jìn)行消毒（在30秒內(nèi)保持雙手完全被GEL覆蓋）用手肘開門進(jìn)入C級(jí)二更（黃色地面）。 在二更更鞋，然后戴上綢帽，綢帽應(yīng)包裹住全部頭發(fā)；再戴上口罩，口罩必須覆蓋嘴、鼻，在腦后勒緊；最后穿潔凈區(qū)連體工作服，依次將左腳、右腳、左手、右手穿入（過程中應(yīng)避免碰觸潔凈衣外表面，同時(shí)潔凈衣也不得接觸地面或墻面）檢查自己的著裝用手肘開門進(jìn)入C級(jí)緩沖間。 在C級(jí)緩沖間，用手肘開門分別進(jìn)入C級(jí)微生物限度檢查室一和檢查

5、室二，帶上無菌手套，再在消毒液中浸泡約30秒。 化驗(yàn)人員用浸泡了消毒液的無菌毛巾，擦拭凈化工作臺(tái)臺(tái)面。 打開傳遞窗，將相關(guān)的檢查用品依次擺放在不銹鋼桌上和凈化工作臺(tái)上。（鑷子和剪刀應(yīng)插入75%酒精棉球中） 準(zhǔn)備7個(gè)沉降菌平皿，做好標(biāo)記和日期 在凈化工作臺(tái)上和檢查室地面上擺放好沉降菌平皿。 用消毒液清洗浸泡雙手，將消毒毛巾貼好，放在凈化工作臺(tái)臺(tái)面上。凈化工作臺(tái)2個(gè)檢查室地面2個(gè)操作者手指1個(gè)消毒液1個(gè)空白對(duì)照1個(gè)供試液的制備原則根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。所用乳化劑，分散劑、中和劑或滅活劑及其用量應(yīng)證明是有效的，并對(duì)微生物無毒性。供試液的制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度

6、不應(yīng)超過45，時(shí)間不得超過30min常用的供試品制備方法 液體供試品 取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1：10的供試液。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 固體、半固體或粘稠液供試品 稱取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1：10供試液。有必要時(shí)可適當(dāng)加溫（不應(yīng)超過45）。供試液的制備 取10g頭孢氨芐膠囊于磨口瓶中，用無菌剪刀將其剪碎，加入100mlpH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液混勻，作為1：10供試液。靜止得上清液備用。 在供試液靜止沉淀的同時(shí)準(zhǔn)備8個(gè)無菌平皿，每2皿

7、為一組，分別在每組的2個(gè)平皿蓋上分別依次注明“0（空白）,10-1, 10-2, 10-3”。 準(zhǔn)備3瓶膽鹽乳糖培養(yǎng)基，分別在瓶上注明”1-/2,1+/2, 0/2,其中2標(biāo)示當(dāng)月2號(hào)，1表示當(dāng)天所做的第一個(gè)樣品、+：表示樣品陽性，-：表示樣品、0：表示陰性對(duì)照。細(xì)菌和控制菌檢查 薄膜過濾法 制備平皿 準(zhǔn)備2個(gè)無菌平皿，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15-20ml，半蓋蓋，除出去冷凝水后，蓋上平皿蓋待凝。 火焰噴射器在檢驗(yàn)儀的過濾頭表面滅菌35秒鐘。 鑷子在火焰上滅菌并冷卻，夾住3張無菌濾膜放置在3個(gè)過濾頭中央。 將已經(jīng)過滅菌的過濾杯小心安裝在過濾頭上。從過濾杯的上邊緣按下過濾杯卡在過濾頭上。在安裝濾杯

8、的時(shí)候，手不要接 觸濾杯的內(nèi)部 預(yù)潤(rùn)濾膜 將事先插在75%酒精棉球中的剪刀過火焰數(shù)次后，撬去沖洗液瓶子的鋁塑蓋和膠塞，將瓶口和瓶頸部位過火焰數(shù)次。 向3個(gè)過濾杯中，分別加入少量的0.1%無菌蛋白胨水溶液，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)閥門手柄90度，打開過濾頭對(duì)應(yīng)閥門。按下檢驗(yàn)儀的啟停開關(guān)啟動(dòng)儀器過濾。 過濾樣品 分別取10ml上清液（取相當(dāng)于1g供試品），分別加入3個(gè)濾杯中過濾或先將10ml上清液加入100ml0.1%無菌蛋白胨水中混勻，再過濾。沖洗 用800ml0.1%無菌蛋白胨水分次沖洗過濾，每次約100ml，總沖洗量不得超過1000ml。每次沖洗時(shí)沖洗液瓶的瓶口和瓶頸部位應(yīng)過火焰數(shù)次，每次沖洗時(shí)沖洗液瓶的

9、瓶口和瓶頸部位應(yīng)過火焰數(shù)次，在過濾前后，應(yīng)保持濾膜的完整性。在過濾前后，應(yīng)保持濾膜的完整性。 樣品過濾完后，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)閥門手柄90度，關(guān)閉過濾頭對(duì)應(yīng)閥門，然后按啟停開關(guān)停止儀器。 鑷子在火焰上滅菌并冷卻取出第一張濾膜，菌面朝上貼于制備好的培養(yǎng)基平板上。（濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)）。 鑷子再次火焰上滅菌并冷卻分別取出第二張和第三張濾膜，快速接至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，分別做為樣品和樣品陽性。 取10mlpH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中作為陰性對(duì)照。 再用火焰噴射器在滅菌檢驗(yàn)儀的過濾頭 鑷子在火焰上滅菌并冷卻，夾住1張無菌濾膜放置在1個(gè)

10、過濾頭中央。 安裝過濾杯 用少量的0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，過濾。 取出濾膜，貼于培養(yǎng)基平板上做為陰性對(duì)照。酵母菌和霉菌的檢查平皿法樣品的稀釋10-210-110-3每遞增l稀釋級(jí)，必須另換一支吸管。稀釋時(shí)，吸管插入第1級(jí)稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，吸管移至第2級(jí)稀釋管的內(nèi)壁近液面處（勿接觸液面）緩慢地放出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無黏附或殘留液體） 在上述進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管，吸取該級(jí)稀釋液各1ml至2個(gè)滅菌平皿中，（一般為左手持平皿，將蓋半開，右手持吸管），注入平皿時(shí)，

11、將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。 陰性對(duì)照 待各級(jí)稀釋液注皿完畢后，用1支吸管吸取試驗(yàn)用稀釋劑（pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液）各1ml，分別注入2個(gè)平皿中右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手撥出棉塞。右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中玫瑰紅瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，以順時(shí)針或反時(shí)針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿半蓋蓋，除出去冷凝水后，蓋上平皿蓋至操作臺(tái)上待凝傾注培養(yǎng)基注：混勻時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上培養(yǎng)培養(yǎng) 將冷凝后的平板用保鮮膜包裹好，注明檢查日期。 倒置培養(yǎng)，細(xì)菌平板于3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。霉菌、酵

12、母菌計(jì)數(shù)平板于2328培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。 完成微生物限度檢查后，將待培養(yǎng)的樣品、廢棄物等通過傳遞窗傳出。 檢查人員對(duì)潔凈室進(jìn)行清潔。 操作結(jié)束后 操作前 每周 每天清潔和消毒頻率 細(xì)菌數(shù)選取平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋級(jí)。 霉菌、酵母菌數(shù)先取平均菌落數(shù)在30100之間的稀釋級(jí)。 因?yàn)槌^300有凝聚作用，易計(jì)數(shù)偏低，且不易點(diǎn)計(jì)，低于30細(xì)菌分布不是正態(tài)分布，不能代表其正常計(jì)數(shù)，且數(shù)量減少，誤差增大。菌落報(bào)告原則菌落計(jì)數(shù) 一般將平皿置菌落計(jì)數(shù)器或從平皿的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。注意細(xì)菌菌落

13、與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等的區(qū)別。必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。如仍難區(qū)別，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間47天，細(xì)菌菌落常會(huì)生長(zhǎng)增大而加以區(qū)別。菌落計(jì)數(shù) 若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以2個(gè)菌落或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)；若平板生長(zhǎng)有鏈狀菌落，菌落間無明顯界限，一條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈上出現(xiàn)性狀與鏈狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生長(zhǎng)蔓延較大的片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜作為計(jì)數(shù)用。菌落報(bào)告原則菌落報(bào)告原則如只有1個(gè)稀釋級(jí)平均菌落數(shù)在30300（30-100）之間，則將該稀釋級(jí)的菌落乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。稀釋稀釋 菌落數(shù)菌

14、落數(shù) 平均值平均值 報(bào)告報(bào)告10 1 280 260 270 27010270010 2 29 28 10 3 3 2 當(dāng)有當(dāng)有2個(gè)或個(gè)或2個(gè)以上稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定個(gè)以上稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí)，以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告。時(shí)，以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告。如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在30以下，則按最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)以下，則按最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。稀釋稀釋 菌落數(shù)菌落數(shù) 平均值平均值 報(bào)告報(bào)告10 1 10 12 11 1110 11010 2 2 3 10 3 1 3如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均無菌落生長(zhǎng)或最低稀釋級(jí)平均落數(shù)小如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均無菌落生長(zhǎng)或最低稀釋級(jí)平均落數(shù)小于于1小時(shí)，應(yīng)報(bào)告菌數(shù)為小時(shí)，應(yīng)報(bào)告菌數(shù)為1稀釋倍數(shù)個(gè)稀釋倍數(shù)個(gè)/g或或ml。結(jié)果報(bào)告 菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告。 菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)值修約規(guī)則處理。 復(fù)試 供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)其中任一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合格，應(yīng)重新取2倍包裝量供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩份，以三次檢驗(yàn)結(jié)果的平均值報(bào)告。異常情況處理異常情況處理菌落蔓延1.加TTC（1000ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂加1的TTC(2、3、5氯化三苯四氮唑瓊氯化三苯四氮唑瓊脂脂 )1ml )2.開蓋干燥（將已凝固的營(yíng)