生物樣品穩(wěn)定性的考察

1、生物樣品穩(wěn)定性考察的技術要求默認分類2010-06-09 23:58:08 閱讀126評論0 字號：大中小訂閱從指導原則中我們可以理解樣品穩(wěn)定性包含了 5個方面，但申報資料中往往只對其中的 23項進行考察，應引起審評 注意。（1）冰凍穩(wěn)定性（冷凍穩(wěn)定性）：配制好數(shù)份低、中、高含藥生物樣品后冰凍，分別在數(shù)天或數(shù)十天時，取出化凍測定血藥濃度，計算回收率來考察穩(wěn)定性。冷凍穩(wěn)定性（常規(guī)為-20 C）的目的是考察樣品貯存的低溫極限條件。因此所有樣品分析必須滿足一定時間內(nèi)在特定的貯存溫度下的穩(wěn)定性要求。如有些樣品凍存僅一周穩(wěn)定，不能滿足樣品分析周 期要求，可采用合適的方式延長冷凍穩(wěn)定性，如采用超低溫冰箱保

2、存降低冰凍溫度，也可采用加入適當?shù)姆€(wěn)定劑，如含 巰基化合物，添加抗氧化劑維生素 C能大大延長冷凍穩(wěn)定性。（2） 樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性（測定溶液的穩(wěn)定性）：含藥生物樣品于配制好后按血漿樣品的處理項立即處理，置室溫中分別在數(shù)小時或數(shù)十小時時測定，常將測定溶液放置在低溫進樣器中考察。該實驗的目的是，考察在樣 品量大、分析批內(nèi)待機時間長所致的待測樣品發(fā)生的變化或儀器污染/疲勞/基線漂移等所造成的系統(tǒng)偏差。HPLC法中如采用UV或FLD檢測，可采用統(tǒng)計樣品主峰面積 RSD%考察。生物樣本污染較大，當采用MS或MS/MS 檢測時，連續(xù)進樣易污染加熱毛細管，導致主峰面積逐漸下降，此時需要同時跟蹤

3、線性測定進行考察。也可考察降解雜 質(zhì)的變化來判斷，如含奧美拉唑生物樣品通過考察主要降解雜質(zhì)磺酰化物，這種方法有時更為準確。（3）凍融穩(wěn)定性：配制好低、中、高含藥生物樣品，凍融數(shù)次（常 3次），測定血藥濃度，計算回收率來考察穩(wěn)定性。 由于生物樣品分析復雜、誤差大，易產(chǎn)生可疑數(shù)據(jù)，往往需要重新測定來確定數(shù)據(jù)的可信度，該穩(wěn)定性為上述測定提供 保證。如含賴諾普利血樣，冷凍放置7天內(nèi)基本穩(wěn)定，凍融兩次賴諾普利降解 50%以上。解決凍融不穩(wěn)定性的辦法有： 血樣采集分離后，立即定量分成多份冷凍方式，滿足實驗要求。（4） 室溫穩(wěn)定性：配制好低、中、高含藥生物樣品后，在室溫條件下放置數(shù)小時至數(shù)十小時后，按血漿樣

4、品的處理” 項立即處理測定，計算回收率來考察穩(wěn)定性。該實驗目的考察血漿樣品處理過程中，待處理樣品放置的合適條件。如文 獻報道，含尼莫地平血樣在室溫穩(wěn)定性較差，需要凍融后立即處理測定，但這種情況會影響測定的效率，經(jīng)室溫穩(wěn)定性考察后發(fā)現(xiàn)，在嚴格避光條件下，血樣在 24h內(nèi)穩(wěn)定。（5） 儲備液的穩(wěn)定性：對照品儲備液分別置冰箱中（4C）放置數(shù)天數(shù)十天后，取出后直接測定，測定方法可不同于含 藥生物樣品的測定。如僅放置幾天，可采用測定條件連續(xù)測定，計算樣品主峰面積的RSD%來考察；如對照品容易獲得， 可采用新配制對照品溶液外標法計算儲備液的含量來考察；對于昂貴的對照品（如代謝物）可采用 HPLC歸一化法聯(lián)

5、合 吸收系數(shù)法來考察待測成分的變化。生物等效性試驗中樣本保存及前處理應注意的幾個問題生物等效性試驗中樣本保存及前處理應注意的幾個問題生物等效性試驗中樣本保存及前處理應注意的幾個問題審評三部李士敏魏農(nóng)農(nóng)趙明摘要】本文對生物等效性試驗所用生物樣本采集后到檢測前在保存過程中應注意的幾個方面的 問題進行了闡述，希望能對從事此方面研究的人員有所幫助由于生物等效性試驗的樣本來源多為血樣或尿樣，所含的藥物濃度較低，內(nèi)源性干擾成分多，目 標藥物多與蛋白結(jié)合或呈綴合狀態(tài)，在整個試驗過程中，樣本測定周期長，測試工作量大，因此其分 析方法學的要求與一般的藥物分析方法相比具有其自身的特點， 我們在建立方法學時， 應注

6、重以下幾 個方面：一、樣品采集后的的處理和貯存鑒于生物樣本的特點，為了避免樣品中被測藥物發(fā)生分解或產(chǎn)生其他化學變化，取樣后最好立即 進行分析測定，但實際工作中幾乎無法做到，常需將收集到的樣品冷藏、冰凍，臨用前再融化并放至 室溫后使用。在樣本冷凍貯藏前，需及時進行處理。血漿和血清都需要在采血后及時分離（ 24 小時內(nèi)），若不 及時分離，血凝后再冰凍保存，則因冰凍時引起細胞溶解，阻礙血漿或血清的分出，同時因溶血而影 響藥物濃度變化。尿液主要是水、尿素及鹽類，是很好的細菌生長液，因此應在取樣后立即測定。不 能立即測定時，應于4C冷藏，如在室溫保存，則應在采樣后的尿液中加入少量防腐劑甲苯（1%）或氯仿

7、（飽和）。生物樣品中的一些不穩(wěn)定的藥物（如普魯卡因、丙酸、紅霉素、阿糖胞苷） ，易受血漿 酯酶水解的影響，當采好樣品之后應立即加入酯酶抑制劑氟化鈉、三氯醋酸等，防制藥物分解。易氧 化的藥物（如兒茶酚類、阿撲嗎啡等）一般直接在 -15C僅能保存4周；若樣品中加入維生素 C或其 他抗氧劑，則可穩(wěn)定 10周。生物樣品在采樣、貯存與分析過程中都應注意可能造成樣品的損失或污 染，以免將污染物作為藥物新的代謝物。二、生物樣本貯存期間的穩(wěn)定性考察由于生物等效性試驗樣本從采樣到檢測的周期通常需要幾周至幾個月，在其貯存期間目標藥物的 穩(wěn)定性需經(jīng)考察驗證。 含藥樣本穩(wěn)定性是指樣品中的藥物從采樣至測定時性質(zhì)和含量的

8、穩(wěn)定程度，它是貯存條件、藥物的化學性質(zhì)、空白生物樣品和容器系統(tǒng)的函數(shù)，在特定的容器和生物樣品中待測物 的穩(wěn)定性不能外推至其他系統(tǒng)。生物樣本穩(wěn)定性的評價應考察：1、 短期室溫穩(wěn)定性：要求高、低濃度樣本在424 h 內(nèi)穩(wěn)定?？疾鞙囟?、光照、空氣、酶解等因 素。2、長期低溫條件下的穩(wěn)定性：從第一個樣本采集至最后一個樣本的分析為一個考察時間周期，貯 存溫度一般為-20C，如果需要也可在-70C貯存。要求高、低濃度至少分別測定 3次，測得結(jié)果與第 一天測得的相應濃度比較應保持穩(wěn)定。3、凍融試驗：取高、低濃度各 3份于-20C貯存24小時，取岀后在室溫自然解凍，取樣測定，然 后再將樣品放回冷凍 1224小

9、時，如此重復循環(huán)二次以上，分別比較各次測定結(jié)果。4、對照液和內(nèi)標液的穩(wěn)定性：室溫考察 6小時穩(wěn)定性，然后冷藏 714天或恰當?shù)闹芷诤筮M行測 定，與新配溶液的測定結(jié)果進行比較。三、生物樣本的前處理方式在測定體液、組織勻漿等生物樣品中藥物及其代謝物時，首先要將生物樣本中的蛋白質(zhì)除去，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來，以便準確地測定藥物及其代謝物的濃度。除蛋白的方法有：1）加入與水混溶的有機溶劑及中性鹽（如乙醇、甲醇、丙酮和乙腈；硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉；）； 2）加入酸性沉淀劑（如三氯醋酸、高氯酸等） ；3 ）加入重金屬離子（如鉛、鋇、鎢酸等） ；4）組織的酶消化 法（如枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等） 。對于與內(nèi)源性物質(zhì)綴合的藥物同樣需先進行綴合物的水解。 綴合物水解的方法常用的有：