本文旨在研究螢光棒內(nèi)的物質(zhì)對於生物的影響

1、目錄：一、 摘要03二、 研究動機03三、 研究目的04四、 研究器材及設備04五、 研究過程及方法05六、 研究結果14七、 討論19八、 結論20九、 參考資料20 一、 摘要：本文旨在研究螢光棒內(nèi)的物質(zhì)對於生物的影響；選擇以蝦的胰臟細胞、B.cereus, S.aureus, V.damsela, Streptococcus, E.coli, V.alginolytious, A.hydrophia等七種細菌及三斑鯛魚、斑馬魚等作為生物的代表，在實驗室內(nèi)培養(yǎng)細胞及細菌並觀察螢光棒的內(nèi)含物是否會抑制細菌的生長、細胞及生物個體的生存當我們每每在電視上看到無數(shù)隨歌手節(jié)奏舞動的螢光棒，在一場大型

2、演唱會後被隨意丟棄，我們便不禁自問，它們是否有被適當?shù)姆诸惣疤幚砟?？在對七株不同的菌株進行不同濃度的抑菌圈實驗以及將不同量的螢光棒內(nèi)含物加入蝦胰臟細胞培養(yǎng)液共同培養(yǎng)後得知，僅要微量的螢光棒內(nèi)含物質(zhì)，便可以對上述兩種對象產(chǎn)生相當?shù)膿p害以及影響；接下來，我們還將以三鯛斑魚及斑馬魚的魚苗來進行生物個體的實驗然而以目前的結果可初步得知，以一般的掩埋及焚燒法來處理螢光棒，可能不是一項明智的舉動，有待政府相關機構來深入研究，並提出更好的解決之道二、 研究動機我們是一群注重學校課業(yè)，但也更關心週遭環(huán)境變遷與環(huán)保的高中生我們每每在電視上看到無數(shù)隨歌手節(jié)奏舞動的螢光棒，在一場大型演唱會後被隨意丟棄，我們不禁自問

3、，它們是否有被適當?shù)姆诸惣疤幚砟兀吭诟咧械挠袡C化學課程中，我們了解到有機物質(zhì)具有一定的毒性，又由基礎生物中了解到生態(tài)環(huán)境對生物生長的重要性；然而在元宵燈會中，處處可見販賣螢光棒的小販和滿地亂丟的螢光棒，可見此項物品的廣泛使用，甚至可稱之濫用可是由我們針對高中生發(fā)出並回收的問卷（附件一）中，竟然約有80%（80/96）對螢光棒的內(nèi)含物質(zhì)以及其處理方式並不在意這些會發(fā)光的螢光物質(zhì)到底是否對自然生態(tài)有害呢？有什麼不良的影響嗎？因此我們嘗試以實驗的方法來觀察他們對於細胞、細菌及個體的影響三、 研究目的本文旨在研究螢光棒內(nèi)的物質(zhì)對於生物的影響；選擇以蝦的胰臟細胞、B.cereus, S.aureus,

4、V.damsela, Streptococcus, E.coli, V.alginolytious, A.hydrophia等七種細菌及三斑鯛魚、斑馬魚等作為生物的代表，在實驗室內(nèi)培養(yǎng)細胞及細菌並觀察螢光棒的內(nèi)含物是否會抑制細菌的生長、細胞及生物個體的生存，並由本研究的過程中學習研究科學的態(tài)度及實驗的技巧和操作四、 研究設備及器材（詳如附件二）螢光棒 (Cyalume light stick)美國Omni glow公司實驗細胞：蝦胰臟細胞（PMHcell）中研院動物所提供實驗菌株： B.cereus, S.aureus, V.damsela, Streptococcus, E.coli, V.

5、alginolytious, A.hydrophia中研院動物所提供實驗個體：三斑鯛魚魚苗（宜蘭礁溪特有）、斑馬魚魚苗（Zebra Fish）中研院動物所提供五、 研究過程及方法研究過程Sample的取出細菌的實驗細胞的實驗個體的實驗培養(yǎng)培養(yǎng)Sample的加入Sample的加入Sample的加入抑菌圈觀察及統(tǒng)計細胞生長觀察及統(tǒng)計生長觀察及統(tǒng)計（一） 螢光棒內(nèi)含物質(zhì)之取出與稀釋取一刀片，用火燒過，把螢光棒（尚未折過）的外管割破，將外管的液體倒入塑膠試管中（小心內(nèi)管），將螢光棒的內(nèi)管（玻璃管）小心取出，用水把其表面的外管液體沖掉並用紙巾擦乾（避免內(nèi)外管提早反應）；用夾子小心的把內(nèi)管夾破，將其中的液

6、體用電動吸取器裝上1ml的管子吸出，倒入另一試管中，重複上面步驟三次（共有白，紅，綠三色）；用電動吸取器分別從各色的內(nèi)管及外管吸出1ml的液體，並注入一新試管中，將此步驟重複兩次，取得三種不同顏色的混合試劑管接著使用450ul的DMF溶劑溶解50ul的上述試液，並利用階梯稀釋法稀釋得到10-1,10-2,10-3,10-4,10-5的試液.將以上蒐集的54支試管放入試管架中，以待下列兩項實驗使用（二） 細菌、細胞及個體的培養(yǎng)、Sample的加入細菌的培養(yǎng)（） 單一菌落的培養(yǎng)A. 取一個TSA plate。B. 將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒紅，接種環(huán)上方部分亦得以火焰燒過後使之冷卻。C. 將接種環(huán)於

7、養(yǎng)有菌落之液態(tài)培養(yǎng)基中點幾下，使之沾有菌落。D. 打開空白的TSA plate，將沾有菌落的接種環(huán)於其上輕輕連畫數(shù)條橫線後，將培養(yǎng)皿蓋子置回。E. 再次將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒紅並使冷卻，將培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)約60度，畫第二次線。F. 重複上一步驟之操作，畫第三次線。G. 將培養(yǎng)皿倒置，於37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，即可培養(yǎng)出單一菌落。（） Sample的加入A. 將培養(yǎng)好之單一菌落B.cereus刮取少許，置於液態(tài)培養(yǎng)基中。B. 再從液態(tài)培養(yǎng)基中，以Pipet-aid吸取少許液體，滴於固態(tài)培養(yǎng)基上並以三角形玻棒均勻塗抹。C. 重複的步驟，共須塗60個培養(yǎng)基。D. 重複的步驟，做S.aureus, V.da

8、msela, Streptococcus, E.coli, V.alginolytious, A.hydrophia等六株菌的培養(yǎng)。E. 取個B.cereus的培養(yǎng)基，在背面將之分成數(shù)格，分別寫上Red 外管、Red 內(nèi)管、Yellow 外管、Yellow 內(nèi)管、White 外管、White 內(nèi)管、 Red 內(nèi)外管混合、Yellow 內(nèi)外管混合、White 內(nèi)外管混合、 Antibiotic（Kanamycin）、Water、DMF等。F. 以鑷子夾取一個Paper Disc，於其上滴上10ul的紅色外管液體，再將其置於寫有Red 外管的培養(yǎng)基格子上；其他亦同G. 重複做一個培養(yǎng)基（為了實驗的

9、重複性）。H. 重複的步驟，製作S.aureus, V.damsela, Streptococcus, E.coli, V.alginolytious, A.hydrophia等六株菌的培養(yǎng)基。I. 放入三十七度的恆溫箱中培養(yǎng)小時，等待實驗結果細胞的培養(yǎng)實驗（以下實驗皆在中研院動物所的攝氏18度恆溫無菌室內(nèi)進行）（） 細胞的培養(yǎng)A. 先把原在細胞培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)液倒入廢液瓶中B. 電動吸取器裝上5ml的吸管吸取PBS 4ml，加入細胞培養(yǎng)罐中C. 蓋上蓋子，搖晃罐子，使PBS和罐壁均勻接觸D. 把罐內(nèi)液體倒入廢液瓶中E. 重複步驟二至四三次F. 用電動吸取器裝上1ml的吸管吸取tripsi 0.

10、5c.c並加入罐中G. 搖晃罐子，並拍打罐壁H. 用電動吸取器裝上5ml的吸管吸取培養(yǎng)液3ml沖洗罐壁I. 吸起，沖入，重複三次J. 用電動吸取器裝上吸管，吸取少量罐中液體，滴入HemacytometerK. 待其吸入後，拿至反光顯微鏡下算細胞個數(shù)L. 將得到的細胞數(shù)1000，得到每ml培養(yǎng)液中有的細胞數(shù)M. 因為再細胞培養(yǎng)盤中一格需要有1c.c內(nèi)含細胞的培養(yǎng)液；一共有24格，因此用電動吸取器裝上25ml的吸管，吸取48ml的培養(yǎng)液，滴入罐中N. 把罐中內(nèi)含細胞的培養(yǎng)液倒入一乾淨並消毒後的容器中O. 使用電動吸取器裝上1ml的吸管，從上述容器中吸取ml的細胞培養(yǎng)液，並注入細胞培養(yǎng)盤中的小槽中P

11、. 步驟重複48次Q. 拿至反光顯微鏡下觀察細胞是否均勻分布R. 以膠帶密封後平放，靜置於攝氏18度的恆溫室中；讓細胞於其中生長24至48小時（） Sample的加入A. 把步驟的兩個細胞培養(yǎng)盤取出B. 將原來於其中的培養(yǎng)液用電動吸取器裝上1ml的吸管吸出倒入廢液瓶C. 用微量滴管（P200）吸取1c.c的培養(yǎng)液，沿著細胞培養(yǎng)盤內(nèi)槽的槽壁注入24X2個槽中D. 用微量滴管（）（P20）（P200）分別吸取三種顏色的內(nèi)管、外管和混合液體0.5、5、50ul，並依下圖滴入細胞培養(yǎng)盤中的槽內(nèi)Repeat一盤E. 以膠帶密封後，靜置於攝氏18度的無菌恆溫室中，培養(yǎng)24小時，等待實驗結果六、 研究結果（

12、一） 在細菌的抑菌圈直徑測量方面下列圖表分別是七種細菌在做paper disk實驗以後，經(jīng)過兩天攝氏37度的恆溫培養(yǎng)後所產(chǎn)生的抑菌圈直徑（如下列圖表和照片所示）由以下的圖表及照片可看出微量的螢光棒內(nèi)含物質(zhì)即可對細菌的增殖造成抑制的影響（以下表格表示無抑菌圈產(chǎn)生？表示無有數(shù)據(jù)）細菌S.Aureus的抑菌圈直徑大?。╩m）濃度試劑WOWIWMRORIRMGOGIGMDMF抗生素1913118131291228X2010-1X1614X1513X1425X10-2X1815X14XX1712X10-3X1414X11XX12XX10-4X9XXXXXXXX10-5X9XXXXXXXX細菌V.Dams

13、ela的抑菌圈直徑大?。╩m）濃度試劑WOWIWMRORIRMGOGIGMDMF抗生素1191212171315181315X1510-1101513101414111413X10-2X161691315X1413X10-3X12XXXXXXXX10-4XXXXXXXXXX10-5XXXXXXXXXX細菌B.Cereus的抑菌圈直徑大?。╩m）濃度試劑WOWIWMRORIRMGOGIGMDMF抗生素1212113211518231521X2310-111241511131412716X10-2X1412X111191011X10-3X18XXXXXXXX10-4XXXXXXXX9X10-5XX

14、XXXXXXXX細菌Streptococcus的抑菌圈直徑大小（mm）濃度試劑WOWIWMRORIRMGOGIGMDMF抗生素1131214201215261320X1510-1X10X121215?1311X10-2X12XX12XX13XX10-3XXXXXXXXXX10-4XXXXXXXXXX10-5XXXXXXXXXX細菌E.Coli的抑菌圈直徑大?。╩m）濃度試劑WOWIWMRORIRMGOGIGMDMF抗生素120X1320X2220X17X2010-110XXXXX12XXX10-2XXXXXXXXXX10-3XXXXXXXXXX10-4XX12XXXXXXX10-5XXXXXX

15、XXXX細菌V.Elpinolyftious的抑菌圈直徑大?。╩m）濃度試劑WOWIWMRORIRMGOGIGMDMF抗生素1221219271020?1120X2810-116?11159912X12X10-211X1021X12XX12X10-39XX21?XXX16X10-4XXXXXXXX12X10-5XXXXXXXX10X細菌A.Hydrophia的抑菌圈直徑大?。╩m）濃度試劑WOWIWMRORIRMGOGIGMDMF抗生素1291216261215221220X1310-1X1112X12131111XX10-2X12XX12XX11XX10-3XXXXXXXXXX10-4XXX

16、XXXXXXX10-5XXXXXXXXXX（二） 在細胞（蝦的胰臟細胞）的生長與否方面每個槽中皆以以下濃度的sample加入（原有1c.c的PBS培養(yǎng)液在每個槽內(nèi)） 1 2 3 4 5 6除了加入0.5ul sample的槽以外（1-A, 2-A, 3-A, 4-A, 5-A, 6-A, 1-D, 4-D），其他槽內(nèi)的細胞皆萎縮、發(fā)黑，呈現(xiàn)嚴重的死亡狀態(tài)，顯示少量的螢光棒內(nèi)含物質(zhì)就可對細胞造成極致命的影響七、 討論：如前所述，本文主要在於研究螢光棒的內(nèi)含物質(zhì)對於生態(tài)環(huán)境的影響，因此選擇了病毒、細菌、細胞及生物個體作為實驗的對象由於病毒實驗所需的時間、經(jīng)費以及技術超出我們高中生的能力範圍，所以未

17、將病毒納入本研究範圍至於在細菌及細胞的選取上，利用實驗室當時可得到的七種細菌以及生長較為快速的蝦胰臟細胞（PMH）作為實驗對象；而在個體的實驗方面，我們選擇了中研院動物所中可取得的三斑雕魚和斑馬魚來進行實驗，又考慮到時間的因素，我們使用較為敏感的魚苗來做對象但是，實驗的結果是否可以在其他的細菌、細胞以及個體上成立則有待進一步的確認和探討雖然個體的實驗在完成本說明書前尚未完成，但我們相信，經(jīng)由本實驗學習到的實驗過程、方法和技巧在相關的研究上則是一致的在實驗的過程中，為了避免其他外在變因的影響以及考慮到實驗的可重複性，不論是細菌或是細胞的實驗，我們採用兩組實驗分別進行並確定其有一致的結果在整個研究

18、的的過程中，我們花了不少的時間和精力在熟悉整個實驗的流程以及技巧，其中又以最容易遭到污染的細胞實驗遭遇最多問題；例如因為技巧的不純熟及操作上疏忽造成實驗的無效或失敗，此等再再說明實驗技巧、經(jīng)驗及細心對於實驗結果的重要性在研究過程中，我們曾經(jīng)嘗試控制sample的濃度來探討其對細胞生長的影響，但在嘗試的過程中，發(fā)現(xiàn)sample並無法順利溶解於培養(yǎng)液中，在嘗試用酒精、DMF等有機溶劑來溶解sample後，卻因其化性及無法溶解於水中的因素而作罷；最後，我們使用微量及低濃度的sample來進行抑菌圈大小的實驗，而在細胞生長影響的實驗方面，我們改使用微量、並未稀釋的sample，在其中觀察到一些現(xiàn)象，在

19、sample和培養(yǎng)液因本身極性的問題而僅能微量互溶的情況下，竟會在如此微量（10ul）和低劑量（5ul sample滴在1ml的培養(yǎng)液中）的情況下產(chǎn)生如此明顯的抑菌圈和細胞嚴重死亡的結果然而，很奇怪的是，在我們所採用之Omniglow公司所生產(chǎn)的螢光棒外部包裝套上，卻注明著無毒害（NON-TOXIC）八、 結論僅是一支小小的螢光棒，即有許多不容忽視的潛藏危機，僅以六種不同濃度的螢光物質(zhì)，加入七株菌就顯現(xiàn)出其對生態(tài)的影響，看似極微，實則甚鉅在以e-mail（附件三）向政府單位詢問後得知，政府並未將螢光棒列為有毒廢棄物的回收管制範圍，與一般垃圾同等處理，但其毒性亦會危害大自然的分解者細菌，而有毒物質(zhì)流散各處我們僅是高二的學生，能力有限；但我們有極強的環(huán)保意識，盡我們最大的能力，提出警訊與呼籲在實驗結果上，我們分析了螢光棒