預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄的C-sis反義寡脫氧核苷酸在血清中的

1、    預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄的C-sis反義寡脫氧核苷酸在血清中的穩(wěn)定性        【摘要】目的探討自行設(shè)計(jì)合成的C-sis癌基因反義寡脫氧核苷酸(AODN)和C-sis癌基因反義硫代磷酸寡脫氧核苷酸(PS-AODN)血清穩(wěn)定性。方法用小牛血清模擬體內(nèi)條件于不同時(shí)相點(diǎn)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，用高效液相色譜法測定血清中AODN和PS-ODN。結(jié)果AODN在血清中1 h內(nèi)降解43.3%，1天降解53.1%。PS-ODN 1 h降解23.7%，第6天降解59.6%。PS-AODN血清

2、中的穩(wěn)定性明顯高于AODN。結(jié)論P(yáng)S-AODN在血清中有較好的穩(wěn)定性，提示其具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值?！娟P(guān)鍵詞】反義寡脫氧核苷酸，硫代磷酸反義寡脫氧核苷酸，穩(wěn)定性，C-sis原癌基因 The Stabilization of C-sis Proto-oncogene Phosphorthioate Antisense Oligodeoxynucleotides Prevented Restenosis in SerumYang Min, Tang Qidong, Cai Lifeng, Lin Shuguang(Division of Clinical Pharmacology, Guangdo

3、ng Cardiovascular Institute, 510080)【Abstract】ObjectiveTo investigate the stabilization of the self-designed and synthesized C-sis phosphorthioate antisense oligodeoxynucleotides (PS-AODN) and C-sis proto-oncogene antisense oligodeoxynucleotides (AODN) in serum. MethodsThe stabilization of C-sis PS-

4、AODN and C-sis AODN in serum was tested in different time points with HPLC method.ResultsC-sis PS-AODN and C-sis AODN degradation rate were 23.7% and 59.6% in 1 hour and 6 day, 43.3% and 53.1% in 1 hour and 1 day, respectively.ConclusionsC-sis PS-AODN have good resistance to nuclease in serum.【Key w

5、ords】C-sis proto-oncogene; antisense oligodeoxynucleotides; antisense phosphorthuoate oligodeoxynucleotides; Stabilizition反義寡核苷酸作為治療藥物，在癌癥和病毒感染方面的研究己取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展1。近年來，在心血管領(lǐng)域的研究也有了較大的進(jìn)展。在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(ASMCs)增殖過程中，C-sis表達(dá)明顯增高2。而C-sis癌基因的表達(dá)產(chǎn)物為血小板衍化生長因子B(PDGF-B)，是ASMCs遷移和增殖的重要促進(jìn)因子3。在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)及及冠脈成形術(shù)后在狹窄(RACA)中，

6、都有PDGF-B的過度表達(dá)。有報(bào)道表明，C-sis反義寡脫氧核苷酸(AODN)可顯著抑制培養(yǎng)的SMCS增殖及C-sis表達(dá)4。為了進(jìn)行更深入的研究和評(píng)價(jià)我們所合成的C-sis AODN和C-sis硫代磷酸反義寡脫氧核苷酸(PS-AODN)在體外、體內(nèi)的穩(wěn)定性，我們建立了用高效液相色譜法測定血中C-sis PS-AODN和C-sis AODN的方法，模擬體內(nèi)條件，進(jìn)行了血清穩(wěn)定性試驗(yàn)，比較兩者對(duì)抗血清核酸酶降解的能力，為探討所設(shè)計(jì)的C-sis硫代磷酸反義寡脫氧核苷酸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法1.1寡脫氧核苷酸合成用DNA合成儀，合成C-sis癌基因18 mer反義寡脫氧核苷酸(C-sis

7、antisense oligodeoxynucleotides, C-sis AODN)，合成過程中，以硫取代碘進(jìn)行氧化，合成C-sis癌基因18 mer硫代磷酸反義寡脫氧核苷酸(C-sis phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides, C-sis PS-AODN)堿基序列如下：3TACTTAGCGACGACCCGC51.2試劑鹽酸甲氧乙心安(內(nèi)標(biāo)，廣州何濟(jì)公藥廠提供，純度99%)；乙腈(分析純)；去離子水(廣東省心血管研究所臨床藥理實(shí)驗(yàn)室Milli-QRG超純水系統(tǒng)Ultra-pure Water Systen自制)；胎牛血清(天津中科院

8、產(chǎn)品)；滅菌注射用水(廣州番禺市橋制藥廠)。1.2儀器惠普1050高效液相色譜系列，DAD二級(jí)管陣列檢測器，色譜工作站。1.3色譜條件色譜柱：YWG-CN 4.6 mm×150 mm，10 m柱，中國科學(xué)院物理化學(xué)研究所產(chǎn)品；0.1 M TEAA-乙腈-水(3：9：88，v/v)；流速：1.0 ml/min；檢測波長、267 nm柱溫：30。1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取20 l C-sis反義寡脫氧核苷酸(AODN)和C-sis硫代磷酸反義寡脫氧核苷酸(PS-AODN)溶液，加入20 l胎年血清，充分混勻，于37溫育，模擬體內(nèi)進(jìn)行6穩(wěn)定性試驗(yàn)，分別于0、15、30、45、1 h、6 h、1

9、 d、2 d、3 d、4 d、6 d不同時(shí)相點(diǎn)，取出樣品，加入2 l內(nèi)標(biāo)液，加入80 l乙腈沉淀，3 000 rpm離心吸取上清液，真空干燥，殘留物用40 l去離子水重溶，取10 l進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析。用AODN或PS-AODN的峰高與內(nèi)標(biāo)的峰高比，計(jì)算兩種反義寡脫氧寡核苷酸的體外降解率。結(jié)果2.1按色譜條件測定C-sis反義寡脫氧核苷酸、C-sis硫代磷酸反義寡脫氧核苷酸和內(nèi)標(biāo)，血清中成分不干擾C-sis AODN、PS-AODN和內(nèi)標(biāo)峰的測定。40-320 g/ml血濃度范圍內(nèi)線性連良好。血清樣品最低檢出濃度為20 g/ml。日內(nèi)、日間變異系數(shù)為1.55-11.5%。樣品絕對(duì)回收率為96.

10、65±4.29%。樣品血濃度測定方法適合作作內(nèi)、外血濃度測定。2.2C-sis反義寡脫氧核苷酸和C-sis硫代磷酸反義寡脫氧核苷酸在血清中，37溫育，于0、15、30、45、1 h、6 h1 d、2 d、3 d、4 d、6 d不同時(shí)相點(diǎn)的降解率分別為0-59.6%和0-89.6%，結(jié)果見表。表不同時(shí)間點(diǎn)的降解情況時(shí)間AODNPS-AODN峰高比降解率%峰高比降解率%03.6505.050152.3336.2303.3236.4452.2737.81 h2.0743.33.8523.76 h1.8948.23.7625.51 d1.7153.13.7425.92 d1.6255.63.

11、4032.73 d1.2466.02.9641.44 d0.8676.42.5250.16 d0.3889.62.0459.6(注：PS-AODN樣品在15、30和45時(shí)間段內(nèi)無數(shù)據(jù)) 討論平滑肌細(xì)胞遷移和增生是內(nèi)膜增生的主要特征，C-sis反義寡核苷酸可特異地阻斷C-sis原癌基因的表達(dá)，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖。Pickering等發(fā)現(xiàn)，人增殖細(xì)胞核抗原mRNA的反義寡核苷酸可專一性地減少血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中DNA合成及增殖細(xì)胞核抗原蛋白含量。硫代修飾的核苷酸，可在36 h后在人VSMC中檢測到，并能滲入人動(dòng)脈硬化斑塊中的細(xì)胞。因此，可望用反義寡核苷酸用于治療血管增殖性疾病，尤其

12、是血管成形術(shù)后的病人血管的再狹窄。1，4 反義寡脫氧核苷酸用于治療，在體內(nèi)必須有一定的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性好，則體內(nèi)生物半衰期長，生物效應(yīng)提高，用量減少，毒副作用減少，費(fèi)用降低。提高穩(wěn)定性，主要是增強(qiáng)抗核酸酶為43.3%，第6天降解率為89.6%。我們的研究分說明，硫代磷酸化修飾的C-sis PS-AODN具有較好的穩(wěn)定性，提示其具有潛在的臨床應(yīng)用前景。研究中所用的C-sis硫代磷酸反義寡脫氧核苷酸，在結(jié)構(gòu)修飾上與其它反義寡脫氧核苷酸不同，我們是用硫取代碘氧化，對(duì)每個(gè)堿基進(jìn)行硫代磷酸化修飾，使脫氧寡核苷酸中亞磷酸鍵氧化成穩(wěn)定的硫代三磷酸酯健，從而明顯提高抗血清核酸酶降解的能力，增強(qiáng)其血清中的穩(wěn)定性。

13、我們的研究結(jié)果已表明，C-sis PS-AODN在體外血清半衰期為6天，具有良好的穩(wěn)定性。但其體內(nèi)是否具有同樣的穩(wěn)定性，有待進(jìn)一步研究。作者單位:廣東省心血管病研究所臨床藥理室，廣州 510080)蔡立豐：中山大學(xué)生命科學(xué)院藥學(xué)系實(shí)習(xí)生參考文獻(xiàn)1吳耀生.反義寡核苷酸藥用的基礎(chǔ)研究.Foreign Medical Sciences Section on Pharmacy, 1998; 25(8):1401442Dartsch PC, Bauriedel G, Schinko et al. Cell constitution and characteristics of human atherosclerotic p; aques selectively removed by percutaneous atherectory. Atherosclerosis. 1989, 80; 49533Linder V, Giiachelli CM, Schwartz SM et al. A subpopulation of xmooth muscle cells in injured rat arteries express platelet-derived growth factor-B chain mRNA. Circ Res, 1995, 76(6