蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)ppt課件

1、12蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。因此，它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。機(jī)體中的每一個細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。蛋白質(zhì)分離純化是用生物工程下游技術(shù)從混合物當(dāng)中分離純化出所需要的目的蛋白質(zhì)的方法。由于深入研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能需要用到高純度的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)是生物產(chǎn)業(yè)中的核心技術(shù)。3一般程序v預(yù)處理v蛋白質(zhì)的抽提v蛋白質(zhì)粗分級v蛋白質(zhì)純化4預(yù)處理 分離提純某一蛋白質(zhì)，首先要求把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原有的天然狀態(tài)，不喪失生物活性。 常用的破碎方法有： 機(jī)械方法：

2、如均漿噴射、研磨或超聲波 化學(xué)法：如去污劑、有機(jī)溶劑處理 酶學(xué)方法：如溶菌酶處理 5蛋白質(zhì)的抽提 一般的蛋白質(zhì)通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_溶液把蛋白質(zhì)提取出來，再用離心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用緩沖溶液的PH值、離子強(qiáng)度、組成成分等應(yīng)根據(jù)目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。6蛋白質(zhì)粗分級 采用分級鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法將目標(biāo)蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)分離開來。7蛋白質(zhì)純化在蛋白質(zhì)純化過程中，從細(xì)胞破碎一步開始蛋白質(zhì)就脫離了天然的環(huán)境，受到各種不同試劑的干擾，其結(jié)構(gòu)和功能會受到不同程度的可逆或不可逆的損害。因此，在蛋白質(zhì)純化的各步驟都要小心地控制所采用的提純條件，以避免蛋白質(zhì)變性。在提純蛋

3、白質(zhì)過程中需要在每一步檢測蛋白質(zhì)（酶）的存在及提純的情況，即建立蛋白質(zhì)定量檢測方法。8蛋白質(zhì)純化的常用方法 采用分離和提純蛋白質(zhì)的各種方法，主要是利用蛋白質(zhì)之間的各種特性差異：v根據(jù)分子大小不同的分離方法v利用溶解度差別的分離方法v根據(jù)蛋白質(zhì)的吸附性質(zhì)分離v根據(jù)對配基的生物學(xué)特異性1.根據(jù)蛋白質(zhì)分離9根據(jù)分子大小不同的分離方法v透析和超濾透析和超濾：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖、水等分開。v離心分離離心分離：蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開，經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。v凝膠過濾層析凝膠過濾層析：利用凝膠介質(zhì)

4、交聯(lián)度或者孔度（網(wǎng)孔大?。﹣頉Q定凝膠的分級范圍。10利用溶解度差別的分離方法v等電點(diǎn)沉淀和等電點(diǎn)沉淀和PH值控制值控制：等電點(diǎn)時蛋白質(zhì)的凈電荷為零，溶解度最低。相反,有些蛋白質(zhì)在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質(zhì)。v蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析：中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象,其中,增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶,反之為鹽析。v有機(jī)溶劑分級法有機(jī)溶劑分級法：與水互溶的有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同,因此,控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。11

5、根據(jù)蛋白質(zhì)的吸附性質(zhì)分離 某些物質(zhì)，如極性的硅膠和氧化鋁以及非極性的活性炭等，具有吸附能力，能夠以不同強(qiáng)弱的吸附力吸附蛋白質(zhì)。 吸附層析法就是利用這種吸附力的強(qiáng)弱不同而達(dá)到分離的目的。12根據(jù)對配體的特異親和力進(jìn)行純化 配基是指能被生物大分子識別并與之結(jié)合的原子、原子團(tuán)、分子。如酶的作用底物、輔酶及其結(jié)構(gòu)類似物。 親和層析，這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結(jié)合能力。 選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價(jià)連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時，

6、該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。13根據(jù)蛋白質(zhì)帶電狀態(tài)分離 離子交換層析IEC是根據(jù)蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)、在溶液中所帶電荷不同進(jìn)行分離的。 離子交換層析中,基質(zhì)由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì),被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來,其中結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì),結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。14小結(jié) 蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種