2012級全日制研究生分生作業(yè)

1、基因診斷作業(yè)名詞解釋：基因診斷：又稱分子診斷，即通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)，直接檢測遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達是否異常，從而對疾病做出判斷的方法。 實時熒光定量PCR :即實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行解析的方 法，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時 監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的 方法。問答：基因診斷常用到的方法有哪些？答：（1） DNA診斷：核酸分子雜交聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR） 限制性酶切圖分析DNA測序DNA芯片技術(shù)。（2） RNA診斷： 反轉(zhuǎn)錄PCRNorthern印記雜交實時熒光定量 PCR表達譜 基因芯片。TaqMan技術(shù)如何設(shè)計引物和

2、探針？答：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針， 該探針為一寡核甘酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅 熒光基團。 探針完整時， 報告熒光基團發(fā)射的熒 光信號被淬滅熒 光基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-邠切酶活性將探針酶降 解，使報告熒光基團和淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn) 了熒光信號的積累與 PCR產(chǎn)物形成完全同步。如何對鐮刀形細胞貧血和地中海貧血進行基因診斷？答：鐮狀細胞貧血的基因診斷原理在于它的血紅蛋白中的 B珠蛋白 基因發(fā)生了突變， 導(dǎo)致（3鏈第6位谷氨酸變?yōu)榫劙彼?。基?ZT

3、的變換，改變了限制性內(nèi)切酶的位點，因此在酶解 正常人DNA和 患者DNA后再用標記的B珠蛋白基因為探針做 Southern雜交時， 就會出現(xiàn)不同的DNA條帶。B 654地中海貧血是指發(fā)生在（3珠蛋白基因第二外顯子第 654位C T突變而引起的一種地中海貧血。該突變在IVS-II第654位上出現(xiàn)的單堿基取代產(chǎn)生了一個 新的GT二核甘酸，聯(lián)同旁側(cè)序列構(gòu)成了一個新的5'端一場的剪切位點， 同時還激活了 IVSII第579 位處3'端隱匿的剪切位點，從而將 IVS- H nt579nt652之間一段 73bp的內(nèi)含子 序列作為額外的外顯子插入到外顯子2和外顯子3之間，產(chǎn)生了一場的B珠蛋

4、白mRNAo在異常剪切的mRNA中存 在一個提前的終止密碼子，使翻譯提前中止而產(chǎn)生截斷的、不穩(wěn) 定 的異常珠蛋白，導(dǎo)致了正常（3珠蛋白鏈合成減少。文獻：甲狀腺癌的分子診斷有哪些進展？ 答：甲狀腺癌相關(guān)基因1、 染色體重排：RET/PTCS因突變與甲狀腺乳頭狀癌（PTC的發(fā) 生關(guān)系密切。RET/PT霞因突變變現(xiàn)為染色體內(nèi) DNA的重排，重排后 的RET基因由不同啟動子啟動該基因的過度表達。有研究顯示 RET/PTCt排在有輻射接觸史的 PTC患者中常見，并且 RET/PTCt排 有關(guān)的PTC患者較少進展為PDTC或者ATC在未分化甲狀腺癌中也 較少發(fā)現(xiàn)。2、 RA渝變：RAS編碼的蛋白能夠傳遞生

5、長信號，結(jié)合 GTP時為 活化狀態(tài)，而結(jié)合GDP時為失活狀態(tài)，正常狀態(tài)下RAS蛋白與GDP 結(jié)合。參與MAPK途徑的信號傳導(dǎo)。激yS RAS的機制主要是點突變， 導(dǎo)致其GTPase活性下降，使其保持持續(xù)活化狀態(tài)，激活下游MAPK 級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞大量增殖而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。RAS突變在濾泡性甲 狀腺癌、PDTC ATC患者中常見，而在PTC患者中較少見。3、BRAF基因突變和MAPK促分裂原活化蛋白激酶)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑： BRAF基因突變是在人體腫瘤中導(dǎo)致的 MAPK信號通路異常激活的主 要原因。BRAF突變的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中第600位的繳氨酸被谷氨酸替代， 該點突變可導(dǎo)致激活BRAF激酶，繼而激活M

6、APK下游傳導(dǎo)通路。該 基因突變在PTCffi PTC起源的ATC中常見。大量臨床研究表明 BRAF 基因突變和PTC的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)，并且與PTC患者細胞攝碘 能力的的散失也有關(guān)聯(lián)。4、 磷脂酰肌醇-3-激酶信號通路(PI3K/Akt pathways): P13K/Akt細胞信號通路與細胞的生長、增殖、生存及腫瘤發(fā)生有關(guān)。Akt有三種形式，Akt-1,Akt-2和Akt-3。激活的Akt磷酸化下游反應(yīng)蛋白，并可 放大信號級聯(lián)，促進細胞異常增殖和抑制凋亡。而PTEN可以使PIP3去磷酸化，從而阻斷該信號通路。Akt-1,Akt-2在甲狀腺癌中是最常見 及重要的。有報道，在甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)

7、 PIK3CA的復(fù)制和放大，尤其 是FT3口 ATC止匕外，PIK3c頗變在ATC中特別常見，在已分化甲狀 腺癌中少見但可以發(fā)生。PI3K通路中大量基因的改變，包括PIKC頗 變和放大，Ras突變和PTEN突變被發(fā)現(xiàn)有相對較高的患病率，尤其 是FTCffi ATC腫瘤。上述改變可同日t存在，還可以與 BRAF突變同時 在甲狀腺腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)，尤其是 ATC在81%ATC升發(fā)現(xiàn)可同時激 活MAP通道和PI3K通道的基因改變。針對多個信號通道，尤其是 MAP激酶和PI3K/Akt通道，在甲狀腺癌中可能是一種有效和必要的 治療策略。5、 PAX8-PPA吊的重排是染色體 t (2; 3) (q13;

8、 p25)異位的結(jié)果，不僅在甲狀腺癌可發(fā)現(xiàn)，特別是FTC而且在濾泡狀腺瘤中也有PAX8-PPAR的重排。它可導(dǎo)致FTC細胞失分化，從而轉(zhuǎn)化為低分化 甲狀腺癌(PDTC)在ATC的作用還不明確。6、 P53基因失活：P53基因點突變導(dǎo)致基因的失活，在ATC口 PDTC分別有約60嘛口 25%的發(fā)生率。并且，在同時存在分化良好和未分化 的成分的腫瘤組織中，P53基因突變也僅僅發(fā)生在未分化的腫瘤細胞。所以推測P53基因的失活發(fā)揮著使腫瘤細胞失分化(表型改變)，從 而導(dǎo)致PDT5口 ATC發(fā)生的作用。7、 甲狀腺癌的表觀遺傳調(diào)控：在甲狀腺癌中最顯著的是 CpG島的 DNA甲基化模式改變，如鈉-碘同向轉(zhuǎn)運體和促甲狀腺素受體。DNMTs 引起的啟動子的甲基化會引起基因沉默和甲狀腺癌的進一步去分化。所以應(yīng)用DNMT抑制劑可以起到是腫瘤再分化，從而對提高腫瘤對一 般的治療方式，比如碘131的敏感性。另外組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾的研 究近