WB灰度值測定

1、Image J關(guān)丁用 Image J 重化 wester法，然鵝小伙伴們卻一直不確定到底 光密度弄混淆。今天咱們一起就這個機, 灰度值？以下是兩種方法的具體操作。方率-:1、打開Image J 軟件一左帶擺正）2、把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片：3、A個矩形工具一選上所有條帶測到了 WB條帶灰度俏nblot條帶灰度值，在網(wǎng)上一直盛傳著兩種操作方那種才是正確的測量灰度方法，甚至將灰度與會學(xué)習(xí)卜，請先看看你是用以下那種方法測量:上角 file Open 選擇自己的條帶圖片（事先把條Image ftype - 8-bit（_L O U D _ 4、A A Q | 二/ 。，7 一 ：一 口DO口o4、 ana

2、lyze fGels f select fir開選取，如：框選 A個條帶一z到余下條帶一 Gelsfselect nextlan5、選中直線工具，將開口波峰關(guān)st lane f Gels - plot lanes（在這第四步也可以分analyze Gels 一 select firstlane 一將令-個框拖移e ）用1 u二4一+、1 A J d ，i <2<|/ 喬贊Fffl d 匚*一 1 人后口7 L-A KIlAP1 口Ajj 4.-J I IfIjJIrTi.工!1匕；V-I6、選中魔棒工具（正數(shù)第七個），點擊波峰，就得出所有area值。方法1、打開Image J軟件一

3、左上角file 一Open選擇自己的條帶圖片（事先條帶弄正）2、把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片：Image type - 8-bit3、扣除背景：Process Subtract Background - 50pixels 并勾選 LightBackground5、設(shè)定參數(shù)：Analyze fset measurement 勾選 Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density6、Analyze fset scale funit of length選項里改為pixels ,確定 Set ScwleDistance in pi

4、xels: 300Known distance： 1.0。Pixel aspect ratio: 1.0Unit of length: inchClick to Remove Scale GlobalScale: 300 ptxels/inchMHelp Cancel OK ）（心靈手6、圖像分割。Edit - Invert 一選中橢圓圈（手殘黨首選）/不規(guī)則圓圈巧黨義無反顧），手動圈上單個條帶7、Analyze fMeasurement 即得到Intden,重復(fù) 6、7步就得到所有Intden 值RusultsAre Mein 網(wǎng)in lntD»n RawlctDenI 0.009

5、- 73.790 13135 0.641577Q4小伙伴們，你們是哪種方法呢？首先先把結(jié)論說出來，其實兩者得出的Intden 嚴格來說都不是灰度值，前者是面積而后者是光密度值，但用來量化area 和WB條帶都是OK的。Image J 這個軟件在將western blot條帶量化時存在兩種參數(shù)：灰度與光密度（假，暫且這么稱呼，原因下文再說），這兩者在理解使用Image J量化 WB條帶十分重要，請務(wù)必仔細看以下幾個概念。1、灰度（gray）:是指圖像中各種顏色的深淺程度，它以整數(shù)值表示，一般的圖像分析軟件將圖像每個像素點的顏色分為0-255 共256級，每一像素點對應(yīng)的數(shù)值即灰度，灰度值越小物體

6、顏色越深。有興趣的小伙伴，可以隨意用Image J打開一張圖片，光標在圖片上任意移動，得到的 value值最小為0 （純黑），最大為 255 （純 白）。imageJ2.53 (760), y = 1.22 (365), value=0七| A C | /value-2SS。0E309D2、光密度（OD ,真）：也就是吸光度（ A）,光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強度Io與該光線通過溶液或物質(zhì)后的出射光強度Ib比值的對數(shù) OD=lg （Io/Ib ）,其實就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比爾定律。入射光ToQ出射光Tb*明確這兩個概念后，我們再來看為什么稱Image J里的光密度是“假”，因為

7、在圖像分析中的光密度（假）是由灰度值再經(jīng)計算得到的，它是一個相對值，但其算法與OD值的算法類似。只是它白入射光強度由Western blot膠片上最亮區(qū)域的平均灰度值代替，而出射光強度則由待測目標平均灰度值代替。即：圖像分析系統(tǒng)的光密度值=lg（WB 膠片上最亮區(qū)域的平均灰度值/待測目標的平均灰度值），再簡單點來說，就是光密度（假）和正兒八經(jīng)的灰度值有血緣關(guān)系?？偨Y(jié)起來說灰度與光密度（假）都能用來量化western blot條帶，兩種量化任君隨意挑?，F(xiàn)在說回兩種操作方法：方法一：是通過每個條帶上眾多像素點對應(yīng)的灰度值勾畫出一條曲線，最后魔棒點出算出的area值其實就是該條帶所對應(yīng)的面積大小。條

8、帶越大，area值越大。方法二：是通過上文說到的光密度（假）計算方法得出來的，最后得出的Intden 值是所圈面積下的總光密度值，再除以圈下面積area ,得出的是平均光密度值（圖像中陽性區(qū)域每一像素點的OD值疊加后除以測量的面積）。條帶（顏色反轉(zhuǎn)后）越白越亮則Intden/area 越大。所以嚴格意義上來說，方法一方法二最后得出的數(shù)據(jù)都不屬于正兒八經(jīng)的灰度值，但又與灰度值有著千絲萬縷的聯(lián)系。如果只是量化WB條帶，兩種方法是都能選用的，記得標注你得到的結(jié)果是area還是Intden ，但如果你想測出真正的灰度值，那么我們下節(jié)課再來好好談?wù)?，咦？我說話怎么越來越像老師的風格呢，哈哈，同學(xué)們，下

9、課.今天主要講述如何用photoshop 測量 WB灰度值，在講述操作方法之余，小石頭先給大家理一理原理，以便大家更好的理解（文末附操作方法）。照例最先展示下最后的成果圖（其實最后可以用Graphpad 做圖，在此不贅述）：=A2-C2AB.CDE加魔片（平均ten面板巧承灰J度包，施拙度被型冽依總灰魔45.&?62711770.026991|45.5492 斜8062 2226632.2G36622Q10.02C99132,236691G479,5746S1123 39239a410.026991123 36S399103750.3006131 A10S5712S6002699113

10、1.783966170792,019917 1D6S2314590.02G991170.07S93224B14S,6208163 620371S120.026991163 593379247353 189條帚忌萩度30CO0Q1SXJOOOkooo1(KKX)C5COOC好了，開始今天的課程，現(xiàn)在手里有張這樣的WB條帶圖，如何將各條帶灰度0值測量出來?首先我們從基本原理聊起，圖片大小的存儲基本單位是字節(jié)，每個字節(jié)是有8個比特（bit ,音譯為比特，也稱為“位”）組成。一般的圖片都是由眾多像素點構(gòu)成的，灰度模式下一個像素一個字節(jié)，也同時就是 8bit。在上一堂課中，我們曾用ImageJ將圖片轉(zhuǎn)化

11、為灰度圖，就是通過image - type - 8-bit這一步。如果把黑-灰-白連續(xù)變化的灰度值量化為256個灰度級，灰度值的范圍也就為0-255 ,表示亮度由深到淺。G57414S1 5014G從上圖我們可以得知純黑為0,純白為255,中間0-255代表各個不同亮度等級。而通常我們所得到的WB圖片是這樣的:r _ 前者A是沒有轉(zhuǎn)化為灰度模式的，后者B是灰度模式下的。而在灰度模式下，如果按灰度值描述的話，顯然有明顯條帶的的灰度數(shù)據(jù)基本都與0相近，數(shù)值很小,這樣不利于互相比較。所以通常的做法是進行“反相”，也就是將白的地方變?yōu)楹?，黑的地方變?yōu)榘?，顏色顛倒。也就是這樣：照片底片，記不記得底片上人

12、物的頭發(fā)都是白的發(fā)亮，這種就是灰度值255哦；還有做電泳凝膠的小伙伴，得到的凝膠圖就不需要反相了，可以直接進行灰度值分析哦）。我們目前要想測量條帶的灰度值，就只需把那發(fā)光發(fā)亮的地方圈出來，讀取灰度值就可以了，而這一部分就交給photoshop來計算吧。在這里小石頭想敲敲黑板，提醒大家注意下三點：1、由于Photoshop得出的灰度值是平均灰度值，而在比較 WB條帶灰度值時，我們還應(yīng)考慮面積的關(guān)系，以面積與平均灰度相乘得出的總灰度，我們才能更準確地得出條帶之間的表達差異。2、條帶上得出的數(shù)據(jù)其實是相對于背景而言的，這個背景雖然反相之后非常黑了，但畢竟不是全黑的，我們還需要扣除背景的灰度值。并且，

13、背景盡量干凈，這就要求我們在做 WB時多努力了。3、不同圖片的背景是不一樣的，不同圖片的 WB條帶是不能進行相互比較的哦。接下來附上 Photoshop 測量 WB條帶的灰度值的操作方法，其中每一步的意義基本已在上文所介紹，對哪一步操作有不明白的小伙伴可以回過頭再看看的。步驟1 :打開軟件 Photoshop一左上角打開圖片步驟2:將圖片轉(zhuǎn)為灰度模式（如果已經(jīng)為灰度，此步跳過）：圖像一模式一灰度一扔掉步驟3:將條帶擺正（兩種方法）通用步驟：最左側(cè)選取標尺工具一在條帶上畫一條自認本應(yīng)水平的線d限M工X30科叵眩售工月金燈酥色H5?擇器工與HTWW 尺工工G注神工具心？計蝴工具方法一：直接點擊正上

14、方“拉直圖層”（此操作簡便，但有可能使邊緣條帶挪出 界外）Adobe Photoshop CC 2017 t比例拉亶圖層清除X img014.tif 50%（灰色/8） *方法二：圖像一圖像旋轉(zhuǎn)一任意角度一確定步驟4:得到的灰度圖進行適當調(diào)整：圖像一調(diào)整一色階一調(diào)整下圖中三個點，適當將自己的 WB圖片轉(zhuǎn)成黑白對比稍明顯的樣子，如圖（此步也可通過更改亮度/對比度實現(xiàn)：圖像一調(diào)整一亮度 /對比度）步驟5:反相：圖像一調(diào)整一反相步驟6:最左側(cè)多邊形套索工具一延條帶邊緣圈選一圖像一分析一記錄測量析一選擇數(shù)據(jù)點可以只顯灰度值-平均值和面積），依此步依次測量各個條帶，同樣 的方法選取任意一個背景測量背景灰度值。步驟7:導(dǎo)出數(shù)據(jù)，進行處理IlliZJ5r 3 門AaGDf半加酊用 MH超魔'寶麗而*4aS7V2711 ?f 4口26»0丈 _ _ 巴壟蛔里ij,aKUZ2»£01 CD3WI4I- -ni?MT/，TdUH<lI及皿編4H3 e 口加他11益融通1O37