血府逐瘀膠囊對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠Smad信號(hào)通路分子的影響

1、血府逐瘀膠囊對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠Smad信號(hào)通路分子的影響                     作者：陸敏 周娟 陸海英 王飛 劉煜敏 張悅 【摘要】  目的探討血府逐瘀膠囊對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)所致大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)理。方法雄性SD大鼠34只隨機(jī)分為4組：正常組（6只）、假手術(shù)組（6只）、模型組（

2、11只）、血府逐瘀膠囊治療組（11只），采用UUO法建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，造模次日予以血府逐瘀膠囊灌胃治療，3周后檢測血清肌酐和尿素氮含量，觀察腎功能變化；取腎組織進(jìn)行HE和六胺銀染色(periodic acid-silver metheramine, PASM)，觀察腎組織病理變化；采用Western blotting分別檢測腎組織中磷酸化Smad2（phospho-Smad2，p-Smad2），Smad2，Smad4，Smad7蛋白表達(dá)水平，觀察Smad信號(hào)通路分子表達(dá)水平的變化。結(jié)果與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠血肌酐和尿素氮含量顯著上升；腎小管基底膜明顯增厚，部分腎小管上皮細(xì)胞

3、變性，腎小管擴(kuò)張與萎縮并存，腎間質(zhì)明顯增寬，纖維組織增生，大量炎細(xì)胞浸潤；p-Smad2和Smad2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Smad7蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，而Smad4蛋白表達(dá)水平無明顯差異。各項(xiàng)指標(biāo)正常組與假手術(shù)組均無差異。血府逐瘀膠囊治療后，大鼠血肌酐和尿素氮含量顯著降低(P<0.05)，梗阻側(cè)腎組織病理改變明顯輕于模型組，p-Smad2和Smad2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)，而Smad7表達(dá)沒有明顯改變。結(jié)論血府逐淤膠囊可通過抑制梗阻側(cè)腎組織中Smad2蛋白的表達(dá)以及活化，減少Smad通路信號(hào)傳導(dǎo)，從而改善梗阻性腎病模型大鼠的腎功能和腎間質(zhì)纖維化程度。 【關(guān)

4、鍵詞】  血府逐瘀膠囊 腎間質(zhì)纖維化 Smad通路信號(hào)分子腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致的腎臟疾病發(fā)展至后期的共同表現(xiàn)，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因之一。積極防治腎間質(zhì)纖維化，對(duì)慢性腎臟疾病的轉(zhuǎn)歸具有重要意義。近年來的臨床資料顯示，血府逐瘀湯具有改善腎功能、防治腎纖維化發(fā)生、延緩腎功能衰竭的作用1，但其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血府逐瘀膠囊對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）所致腎間質(zhì)纖維化大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其療效及作用機(jī)制，為血府逐瘀膠囊防治腎間質(zhì)纖維化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。    1  材料與儀器    1.1

5、60; 動(dòng)物  雄性SD大鼠34只，SPF級(jí)，體重160180 g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(滬)2002-0002。    1.2  藥物  血府逐瘀膠囊，購自天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，主要成分為桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、地黃、赤芍、牛膝、柴胡、枳殼、桔梗、甘草，用時(shí)將膠囊內(nèi)藥粉用蒸餾水配制成0.24 g/ml的混懸液。    1.3  試劑  血清肌酐檢測試劑盒、血清尿素氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)， BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Pierce公司

6、)，兔抗大鼠磷酸化Smad2多克隆抗體（美國Chemicon公司），小鼠抗大鼠Smad2單克隆抗體（美國Cell Signaling公司），小鼠抗大鼠Smad4單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠Smad7單克隆抗體（美國R&D公司），辣根過氧化物酶耦聯(lián)的小鼠抗兔GAPDH單克隆抗體(上?？党苫瘜W(xué)生物技術(shù)公司)，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的第2抗體(晶美生物工程有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce Pierce公司)。    1.4   儀器純水系統(tǒng)(美國Labconco)，低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司

7、)，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀及電轉(zhuǎn)移儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像和圖像分析儀(上海復(fù)日公司)。Centrifuge 5417R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。LeicaRM213切片機(jī)以及LeicaEG119自動(dòng)包埋機(jī)（德國萊卡公司）。    2  方法    2.1  單側(cè)輸尿管梗阻動(dòng)物模型的建立  大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉，呈左側(cè)臥位固定于手術(shù)板上，常規(guī)消毒，打開腹腔、腹膜，暴露并分離左側(cè)輸尿管，40縫合線在左輸尿管上1/3處兩次結(jié)扎，止血，抗感染，30縫合

8、線連續(xù)縫合關(guān)閉腹腔，間斷縫合皮膚。假手術(shù)組不結(jié)扎輸尿管，其余操作過程均相同。正常組不做任何處理。    2.2  分組與給藥  大鼠被隨機(jī)分為正常組(n=6)、假手術(shù)組(n=6)、模型組(n=11)以及血府逐瘀膠囊治療組(n=11)。治療組于術(shù)后第2天以2.4 g/（kg?d）血府逐瘀藥液灌胃，假手術(shù)組及模型組均以等量生理鹽水灌胃，正常組正常飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。治療21 d后殺檢，取材備用。    2.3  血清腎功能測定  分別采用苦味酸法和二乙酰-肟法測定大鼠血清肌酐以及尿素氮含

9、量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。    2.4  腎組織病理染色  取左側(cè)腎臟1/4大小組織塊，以10%中性福爾馬林緩沖液固定，經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片后分別進(jìn)行HE和PASM染色。    2.5  腎組織中Smad通路信號(hào)分子蛋白表達(dá)分析  采用Western blot法。取100 mg左右腎組織置于1 ml RIPA勻漿緩沖液中勻漿，離心(12 000 r/min，10 min，4),留取上清，BCA蛋白檢測試劑盒測定裂解液蛋白濃度。按比例加入適量6×SDS上樣緩沖液，100變性5

10、min，取30 g的組織蛋白樣本經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Pierce Chemical Company, USA，簡稱標(biāo)本膜)。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉標(biāo)本膜1 h，然后分別加入兔抗p-Smad2抗體(1500)、小鼠抗Smad2抗體(11 000)、小鼠抗Smad4抗體(1200)、小鼠抗Smad7抗體(1500)，4孵育過夜，洗膜，再與相應(yīng)的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的第2抗體室溫作用1 h，充分洗滌后，用ECL試劑檢測標(biāo)本膜上的信號(hào)，X-片記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以計(jì)算機(jī)成像和圖像分析儀，測定X-片上雜交條帶的光密度值，代表蛋白的表達(dá)量。同一張標(biāo)本膜曝光后

11、以0.5%十二烷基硫酸鈉洗脫抗體，再與GAPDH抗體(15 000)孵育雜交，作為內(nèi)參照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批以上不同樣本。    2.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。    3  結(jié)    果    3.1  大鼠體重增長、腎臟重量變化比較見表1。造模后大鼠體重增加明顯低于正常組與假手術(shù)組(P<0.01)，治療組體重增加高于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。留取左側(cè)腎臟時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組與治療

12、組大鼠左側(cè)腎臟較右側(cè)明顯增大，顏色變淺，有尿液潴留，腎皮質(zhì)變薄，腎盂擴(kuò)張。模型組與治療組左腎腎體比及左右腎重比均顯著高于正常組與假手術(shù)組(P<0.01)，模型組與治療組無明顯差異。正常組與假手術(shù)組體重增長、左腎腎體比以及左右腎重比均無明顯差異。百事通    3.2  各組大鼠血清肌酐與尿素氮含量比較見表1。  模型組、治療組血肌酐含量顯著高于正常組和假手術(shù)組，以模型組為重，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）。模型組尿素氮含量顯著高于正常組、假手術(shù)組與治療組（P<0.05），治療組與正常組、假手術(shù)組比較差異

13、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常組與假手術(shù)組比較無明顯差異。表1  各組大鼠體重增長、腎臟重量以及血肌酐、尿素氮測定結(jié)果比較與模型組比較，*P<0.05，*P<0.01；左腎腎體比為左腎重量×2與體重之比；n6    3.3  各組大鼠腎組織病理檢查結(jié)果比較見圖1。梗阻側(cè)腎組織HE染色和PASM染色可見模型組大鼠腎小管擴(kuò)張，部分腎小管萎縮，腎小管上皮細(xì)胞濁腫，部分壞死與脫落，腎小管基底膜明顯增厚；腎間質(zhì)明顯增寬，成纖維細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增生；皮質(zhì)中腎小球數(shù)量明顯減少，腎小球形態(tài)基本正常。血府逐瘀膠囊治療組大鼠皮質(zhì)中腎小球數(shù)

14、量明顯多于模型組，腎間質(zhì)略有增寬，擴(kuò)張與萎縮的腎小管數(shù)量少于模型組，腎小管基底膜輕度增厚，腎小管上皮細(xì)胞以變性為主，少見壞死，病變明顯輕于模型組(圖1)。    3.4  各組大鼠腎組織中Smad通路信號(hào)分子蛋白表達(dá)比較  Wsetern blot顯示，模型組腎組織中p-Smad2與Smad2蛋白表達(dá)均顯著高于正常組與假手術(shù)組(圖2，表2)，Smad7蛋白表達(dá)顯著低于正常組與假手術(shù)組(P<0.01)(圖3)。中藥血府逐瘀膠囊能明顯抑制p-Smad2與Smad2蛋白表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但對(duì)Smad7蛋白

15、表達(dá)沒有明顯影響。Smad4蛋白表達(dá)各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。p-Smad2，Smad2， Smad7蛋白表達(dá)，正常組與假手術(shù)組無明顯差異。    4  討論    單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)模型是目前國際公認(rèn)的腎小管間質(zhì)纖維化模型。該模型由于尿液排出受阻,腎盂及腎小管壓力增高,導(dǎo)致腎盂等集合管系統(tǒng)擴(kuò)張,腎間質(zhì)水腫,局灶性炎癥細(xì)胞浸潤,最終造成腎間質(zhì)纖維化及腎萎縮。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)改良的大鼠腎間質(zhì)纖維化模型2，觀察到UUO模型大鼠左腎腎體比、血肌酐、尿素氮含量較正常組和假手術(shù)組顯著增高，梗阻側(cè)腎組織病理染色顯示腎小管擴(kuò)張

16、萎縮并存、腎小管基底膜增厚，腎間質(zhì)增寬、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生，證實(shí)單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)纖維化模型已制備成功，與文獻(xiàn)報(bào)道一致3,4。    腎間質(zhì)纖維化是腎臟受到各種致病因素作用后，慢性損傷與修復(fù)反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行的結(jié)果。根據(jù)中醫(yī)“病久入絡(luò)”“久病在血”的理論，腎間質(zhì)纖維化的中醫(yī)病機(jī)可概括為氣滯血淤，淤血內(nèi)停，阻滯于腎絡(luò)。血府逐瘀湯由桃紅四物湯合四逆散加桔梗、牛膝而成。全方行氣活血，化淤止痛，專為“胸中血府血淤”而設(shè)，故臨床以血府逐瘀湯加減，采用活血化瘀法治療腎纖維化，取得了滿意的療效5。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血府逐瘀膠囊對(duì)UUO大鼠灌胃治療21 d后，觀察到治療組

17、大鼠血肌酐、尿素氮含量較模型組顯著降低，組織病理染色顯示其病理改變也明顯輕于模型組，說明血府逐瘀膠囊對(duì)梗阻性腎病的腎功能及腎間質(zhì)纖維化具有明顯的改善作用。表2  各組大鼠腎組織中p-Smad2與Smad2蛋白表達(dá)比較與模型組比較，*P<0.05,*P<0.01；n=3    腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多途徑、多環(huán)節(jié)的作用過程，涉及多種細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控，其中轉(zhuǎn)化生長因子-1(transforming growth factor 1, TGF-1)是國際公認(rèn)的最重要的促纖維化因子之一。大量研究證實(shí)，Smad蛋白是TGF-1信號(hào)從受體到核的細(xì)

18、胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Smad蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能不同可分為3類：第1類為受體調(diào)控型Smads，包括Smad2和Smad3；第2類為Co-Smad，即Smad4；第3類為抑制型Smads，即Smad6和Smad7。Smad2和Smad3能直接被跨膜的TGF-1第1類型受體激酶磷酸化，活化的Smad2/Smad3與Smad4形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，激活TGF-1靶基因的表達(dá)，加速腎纖維化的進(jìn)展6。Smad6和Smad7是Smad信號(hào)通路中的逆向調(diào)控因子，它們可通過與磷酸化的Smad2/3結(jié)合或與活化的受體結(jié)合，直接或間接地減少Smad2/3的活化，從而阻斷Smad通路信號(hào)傳導(dǎo)，抑制腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展7。本

19、實(shí)驗(yàn)中Western blot結(jié)果顯示，UUO模型大鼠腎組織中p-Smad2，Smad2蛋白表達(dá)較正常組和假手術(shù)組顯著上調(diào)，Smad7蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，表明存在Smad信號(hào)通路分子的活化。血府逐瘀膠囊可明顯降低增高的p-Smad2和Smad2蛋白表達(dá)水平，但對(duì)Smad7蛋白表達(dá)影響不大，說明血府逐瘀膠囊能明顯抑制Smad2蛋白的表達(dá)和活化，從而減少Smad通路信號(hào)傳導(dǎo)，但這種作用不是通過上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)中Smad4蛋白表達(dá)水平雖然無明顯變化，但可能存在其它因子例如Smad轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN/Ski與p-Smad2競爭結(jié)合Smad4，減少活化的Smad2與Smad4異源復(fù)合物的形成的情況8。這有待于今后的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。    上述實(shí)驗(yàn)提示，血府逐瘀膠囊抑制Smad2蛋白的表達(dá)與活化，減少TGF-1依賴的Smad信號(hào)通路的激活，可能是其抗腎間質(zhì)纖維化的重要作用機(jī)制之一。【參考文獻(xiàn)】  1 張史昭，潘達(dá)亮，于 偉，等.腎絡(luò)瘀阻與腎纖維化關(guān)系的臨床研究J.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2003,4(8)：458.2 劉克劍，張 悅，李