凝膠定量軟件Quantity_One使用簡(jiǎn)介

1、凝膠定量軟件Quantity One使用簡(jiǎn)介1、內(nèi)容簡(jiǎn)介凝膠電泳是每個(gè)做分子生物學(xué)的同學(xué)天天都要打交道的基本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，比較有名的比如BandScan、BandLeader、Sigma Gel 等等。今天要向大家介紹的是來(lái)自Bio-Rad 的1D 凝膠定量軟件Quantity One （Bio-Rad還有一個(gè)做2D 凝膠分析的軟件PDQuest）。這個(gè)軟件的最新版本可以在Bio-Rad 的主頁(yè)免費(fèi)下載。目前的最新版本是4.52版 2、Quantity One的定量方法Quantity One的分析功能顧名思義主要用來(lái)進(jìn)行凝膠或

2、者培養(yǎng)皿的熒光定量分析。它的分析功能或者說(shuō)分析方式主要有4種：泳道/條帶軌跡定量法；等高線直接定量法；菌落計(jì)數(shù)；分子量測(cè)定這三種方法中使用最為方便也是最為廣泛的應(yīng)該是等高線定量法（Volumn Contour）。它通過(guò)半自動(dòng)描繪電泳條帶的等高線邊緣來(lái)得到等高線區(qū)域內(nèi)部面積，再將該面積乘以區(qū)域內(nèi)平均光密度值得到條帶內(nèi)部總的信號(hào)量。當(dāng)然這種分析方法的弊病顯而易見(jiàn)：無(wú)法同等得排除不同泳道的背景亮度；等高線的繪制處于“半自動(dòng)”狀態(tài)，即需要人為判斷作為等高線標(biāo)準(zhǔn)的電泳條帶的邊緣；最致命的是在幾個(gè)電泳條帶距離十分接近的時(shí)候幾乎無(wú)法繪制單一條帶的輪廓（常出現(xiàn)連續(xù)的幾個(gè)條帶等高線相連而無(wú)法分離出單獨(dú)條帶的輪廓

3、）。三種方法中個(gè)人感覺(jué)最為科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽?yīng)該是泳道/條帶軌跡定量法（Trace Tracking）。這種方法使用起來(lái)步驟較為繁瑣，必須通過(guò)泳道識(shí)別-電泳條帶識(shí)別兩個(gè)連續(xù)的步驟才能進(jìn)行定量。然而這種方式的最大優(yōu)點(diǎn)在于它可以完全拋棄人為主觀因素進(jìn)行全自動(dòng)定量。他的定量方式為：首先根據(jù)不同電泳條帶的光密度值繪制光密度曲線，然后計(jì)算光密度曲線下面積作為電泳條帶的定量根據(jù)。大家可能會(huì)問(wèn)他能不能排除泳道背景？答案是肯定的，它能夠最大程度的排除不同泳道之間的背景差異，讓各個(gè)泳道上的不同電泳條帶在一條幾乎相同的起跑線上進(jìn)行對(duì)比。這個(gè)背景排除功能是等高線法無(wú)法做到的（等高線法也有基本的背景排除辦法，但是和泳道/條

4、帶軌跡定量法的背景排除不是一個(gè)等級(jí)的。等高線法只能排除同一泳道上的背景，而不能均等的排除不同泳道的背景）。另外泳道/條帶軌跡定量法還可以結(jié)合Gauss Model Bands對(duì)緊密相連的電泳條帶進(jìn)行分析，而這種條帶也是等高線法無(wú)法分析的。我們此次重點(diǎn)學(xué)習(xí)這個(gè)方法。第三個(gè)分析功能是菌落計(jì)數(shù)（Colony Counting）。這個(gè)功能其實(shí)很實(shí)用，可以分析藍(lán)白篩選的結(jié)果。另外Quantity One還可以通過(guò)回歸曲線測(cè)定分子量。 3、Quantity One的基本常用菜單操作下面讓我們了解一下Quantity One常用的基本菜單操作。打開(kāi)文件：由于Quantity One 是Bio-Rad 的硬件

5、配套軟件，因此Quantity One 可以自動(dòng)輸入來(lái)自Bio-Rad 公司的凝膠分析儀的數(shù)據(jù)。具體支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers ”里面設(shè)置。如果您的實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有采用Bio-Rad 的硬件設(shè)施也沒(méi)關(guān)系。您只要將電泳圖片用ACDSee 等程序轉(zhuǎn)換為T(mén)IF 圖片格式就可以被Quantity One識(shí)別了。注意Quantity One只支持8位和16位灰度的TIF 文件。PHP 代碼:Quantity One 似乎有一個(gè)小bug，就是在按“Open”之后并沒(méi)有立刻彈出資源管理器讓你選擇目標(biāo)文件的位置。其實(shí)你只要將鼠標(biāo)在屏幕右下方點(diǎn)擊一下，資源管理器就會(huì)乖乖彈出

6、來(lái)了。PHP 代碼:Quantity One 只能分析白色背景+黑色條帶的電泳圖。而我們正常情況下得到的一般都是黑色背景+白色條帶的電泳圖。我們可以在“Image-Invert data中將圖片色彩進(jìn)行反轉(zhuǎn)，然后便可以用Quantity One進(jìn)行分析了。文字注釋?zhuān)篞uantity One提供基本的文字注釋功能。您可以在您的電泳圖片上記錄您的分析結(jié)果比如電泳條帶的分子量、光密度值、物質(zhì)的量等等。這個(gè)功能可以通過(guò)“Edit-Text Overlay Tools”來(lái)實(shí)現(xiàn)。在彈出的浮動(dòng)工具欄中選擇“ABC ”或者“”就可以進(jìn)行文字輸入和畫(huà)標(biāo)記線的操作。 光密度工具：在“View-Plot Densi

7、ty”的下級(jí)菜單中大家會(huì)見(jiàn)到幾個(gè)和電泳條帶光密度值相關(guān)的顯示選項(xiàng)。大家可以分別選擇不同的選項(xiàng)感受一下它們之間的差別。選擇方法是點(diǎn)擊相應(yīng)的下級(jí)菜單比如“Plot Cross Section ”，然后將變成帶一個(gè)藍(lán)色感嘆號(hào)的鼠標(biāo)移到您想知道光密度的位置，點(diǎn)擊一下就會(huì)顯示該處的光密度相關(guān)信息。在下面這幅圖片中我們可以看見(jiàn)兩條黃線交叉處的電泳條帶的相關(guān)信息。上方的一串曲線是不同泳道之間在同一水平線上的光密度比值曲線；左邊是黃線交叉處所在泳道的幾個(gè)電泳條帶的光密度分布情況。 3D Viewer：在“View-3D Viewer”菜單中大家會(huì)看到一個(gè)有趣的功能叫做3D Viewer。這個(gè)玩意按照Bio-R

8、ad 的說(shuō)法可以輔助辨別幾條緊密相連在一起的電泳條帶的分布情況。大家只要選擇了這個(gè)命令后鼠標(biāo)就會(huì)一個(gè)“+”型，然后將+型移動(dòng)到您感興趣的位置，拖動(dòng)鼠標(biāo)畫(huà)出一個(gè)正方形區(qū)域，然后用鼠標(biāo)雙擊，Quantity One就會(huì)將這塊區(qū)域按照gauss 分布規(guī)律渲染成一個(gè)三維模型，頗有意思。但個(gè)人感覺(jué)這個(gè)功能噱頭多于實(shí)用。 4、Quantity One的基本背景排除功能最開(kāi)始的時(shí)候我們就說(shuō)過(guò)Quantity One的等高線定量模式也有一種比較基本的背景排除方法。這個(gè)方法同樣也適用于泳道/條帶定量模式?，F(xiàn)在我們就來(lái)學(xué)習(xí)這個(gè)方法?；颈尘芭懦墓δ芪挥凇癐mage-Substract backgroud. ”和

9、“Image-Filter Wizard.”這兩個(gè)菜單。Image-Filter Wizard：這個(gè)功能是對(duì)原始圖片做一些初步的加工，主要是除去一些圖片上的“斑點(diǎn)”。這些斑點(diǎn)主要有兩種類(lèi)型：一種是深色的“胡椒面”型和淺色的“食鹽”型，兩種斑點(diǎn)都可以毫不猶豫地去除。從“Image-Filter Wizard.”菜單調(diào)出向?qū)Р藛魏筮x擇“pepper ”和“salt ”，下面兩個(gè)選項(xiàng)可以按照程序默認(rèn)的選項(xiàng)，然后“OK ”就可以完成這第一步的降噪過(guò)程。 Image-Substract backgroud：這個(gè)功能是真正對(duì)圖片背景進(jìn)行清理的工具（區(qū)別于“Image-Filter Wizard.”的降噪模

10、式）。只是這種清理是一種“全局”型的清理，即它以相同的參數(shù)對(duì)每條泳道進(jìn)行背景清理。然而在清理方式上它還是可以分成兩種不同的方式： Backgroud Box：一種是以一個(gè)局部小面積為標(biāo)準(zhǔn)背景，將整張電泳圖片上所有比該區(qū)域光密度值低的區(qū)域全部漂白。這種發(fā)式稱(chēng)為“Backgroud Box”。操作時(shí)用鼠標(biāo)選中對(duì)話框下部左側(cè)的“Backgroud Box”按鈕，然后用鼠標(biāo)在電泳圖片上選擇一塊色彩接近于背景色，色澤比較均勻的區(qū)域，用鼠標(biāo)拖動(dòng)畫(huà)出一個(gè)正方形。釋放鼠標(biāo)后程序就會(huì)立即對(duì)電泳圖片進(jìn)行降低背景的處理； Backgroud Stripe：相對(duì)于“Backgroud Box”來(lái)說(shuō)是一種更加智能化的處

11、理方式。它特別適用于梯度凝膠，即凝膠濃度由上至下依次變化。由于梯度膠的光密度值在一定距離內(nèi)不斷變化，因此如果采用“Backgroud Box”的方法除背景就會(huì)發(fā)生偏差。Quantity One此時(shí)提供一種隨著凝膠濃度變化而變化的除背景方式就是“Backgroud Stripe ”。和“Backgroud Box ”類(lèi)似，選擇右下角的“Backgroud Stripe ”按鈕，然后用鼠標(biāo)沿著電泳泳道拖放形成一個(gè)狹長(zhǎng)的剪影帶（Stripe），這個(gè)剪影帶內(nèi)部的光密度值順著泳道逐漸升高或降低。Quantity One根據(jù)這個(gè)Stripe可以動(dòng)態(tài)的對(duì)整張圖片的背景進(jìn)行剪影。比如泳道起始處光密度低，那么Q

12、uantity One在此處的剪影值也降低；隨著Stripe向前延伸，光密度值逐漸升高，Quantity One也同樣不斷加大剪影的強(qiáng)度。這樣一來(lái)就可以排除由于梯度膠帶來(lái)的背景不一致的影響因素 5、Quantity One的電泳泳道分析功能-創(chuàng)建泳道前面說(shuō)過(guò)Quantity One之所以強(qiáng)大是因?yàn)樗哂械挠镜?條帶軌跡定量法。現(xiàn)在我們就來(lái)學(xué)習(xí)一下如何在電泳圖片上創(chuàng)建泳道（Lane）以及如何進(jìn)行針對(duì)不同泳道的背景排除。創(chuàng)建泳道：首先打開(kāi)我們要分析的電泳圖片（以蛋白質(zhì)電泳為例）。然后選擇“Lane-Auto Frame lanes ”。這時(shí)如果您的電泳圖片比較標(biāo)準(zhǔn)的話，QuantityOne 就會(huì)

13、自動(dòng)識(shí)別出每條電泳泳道的位置，而且將各個(gè)泳道的路徑用一條紅線標(biāo)畫(huà)出來(lái)；如果您對(duì)軟件自動(dòng)標(biāo)記的泳道不甚滿(mǎn)意，您可以通過(guò)“Lane-Edit Frame”下級(jí)各個(gè)子菜單提供的功能對(duì)泳道框架位置、大小等進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方法就是通過(guò)鼠標(biāo)的拖放來(lái)實(shí)現(xiàn)，大家可以自己體驗(yàn)一下；如果您只需要分析其中幾個(gè)泳道的數(shù)據(jù)而不想其他泳道的標(biāo)記干擾您的視線，您可以通過(guò)“Lane-Single Lane-Remove Lane ”刪除您不需要的泳道的標(biāo)記。PHP 代碼:不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被Quantity One自動(dòng)識(shí)別。在不能自動(dòng)識(shí)別的情況下，Quantity One就會(huì)彈出對(duì)話框告訴您它不能識(shí)別泳道。這時(shí)大家

14、就需要手工繪制電泳泳道。方法和上面一樣，同過(guò)“Lane-Single Lane-Creat Lane”來(lái)實(shí)現(xiàn)。只要用鼠標(biāo)在您的電泳圖片上順著待標(biāo)記的泳道的中軸線拖放就可以繪制出該泳道的標(biāo)記紅線. 6、Quantity One的電泳泳道分析功能-排除背景前面說(shuō)過(guò)Quantity One之所以強(qiáng)大是因?yàn)樗哂械挠镜?條帶軌跡定量法?，F(xiàn)在我們就來(lái)學(xué)習(xí)一下如何在電泳圖片上創(chuàng)建泳道（Lane）以及如何進(jìn)行針對(duì)不同泳道的背景排除。排除背景：首先請(qǐng)大家注意，這個(gè)排除背景和前面我們?cè)凇癐mage ”菜單中使用的“Substruct Backgroud”有所不同。后者排除背景的對(duì)象是整個(gè)電泳圖片而非將各個(gè)電泳泳

15、道的背景分別進(jìn)行排除?，F(xiàn)在我們要學(xué)習(xí)的這個(gè)命令可以幫助我們分別排除各個(gè)泳道（也可以將全部泳道用相同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行排除）的不同的光密度背景。這個(gè)功能對(duì)我們以后的分析影響甚大，大家一定好好學(xué)習(xí)。首先我們要將我們的電泳圖片進(jìn)行前面談到的泳道識(shí)別，不管是自動(dòng)方式還是手工識(shí)別。然后選擇“Lane-Lane Backgroud. ”命令。選擇該命令后，鼠標(biāo)即變成一個(gè)綠色的“+”，將鼠標(biāo)移到您打算進(jìn)行背景排除的泳道（比如下圖中的第4泳道），點(diǎn)擊左鍵一下，立刻就會(huì)彈出如下圖所示的對(duì)話框。 其中“Optical Density”顯示得是該泳道光密度值的分布情況。大家會(huì)注意到這個(gè)分布曲線并不是緊貼著縱軸，而是位于縱軸上

16、方分布。造成這個(gè)“懸空現(xiàn)象”的原因就是該泳道自身存在著一定的光密度“背景”。這個(gè)背景的存在導(dǎo)致該泳道上各個(gè)電泳條帶之間不能處于同一水平進(jìn)行對(duì)比；如果考慮到相鄰的其他泳道更是因?yàn)椴煌尘暗拇嬖诙鵁o(wú)法對(duì)比不同泳道上的不同電泳條帶。如何去除這個(gè)背景呢？我們繼續(xù)看右邊的“Lane Backgroud Substruction”對(duì)話框。這個(gè)對(duì)話框的上方“All Lanes”表示可以對(duì)所有泳道進(jìn)行一次性處理；下方的“Selected Lane”表示僅針對(duì)此次選中的這個(gè)泳道進(jìn)行處理（我們選中的是第4泳道）。我們用鼠標(biāo)選擇“Selected Lane”的“Lane On”選項(xiàng)。然后在下面的“Rolling D

17、isk Size ”里填上“5”，再按“回車(chē)”鍵。好！大家再來(lái)看看現(xiàn)在“Optical Density”中出現(xiàn)了一條緊緊沿著光密度曲線分布的醬色曲線。這條曲線將泳道的背景與電泳條帶的光密度分布十分精確的劃分開(kāi)來(lái)。PHP 代碼:大家可能會(huì)好奇這里的“Rolling Disk Size”指得是什么意思？我們可以將Quantity One提供的去除背景功能想象成是一個(gè)滾動(dòng)的小球。如果這個(gè)小球的半徑越小，那么它沿著光密度曲線滾動(dòng)時(shí)滾過(guò)的路徑就越發(fā)精細(xì)，具體反映在醬色曲線的軌跡越發(fā)靠近黑色光密度分布曲線的基線。因此從理論上來(lái)說(shuō)“Rolling Disk Size”的取值越小，它的去除背景效果越好。大家可

18、以試著選擇一個(gè)較大的值比如80，再來(lái)看看此時(shí)醬色曲線的軌跡。當(dāng)然也不能取太小的值。因?yàn)槿绻≈堤?，大家可以想象這個(gè)十分微小的球就會(huì)滾入光密度曲線內(nèi)部，造成有效陽(yáng)性信號(hào)的損失。個(gè)人感覺(jué)520是一個(gè)比較好的取值范圍. OK！我們?cè)僭凇癓ane Backgroud Substruction ”對(duì)話框的最下方鉤選“Show Lane Trace with Backgroud Substructed”，再來(lái)看看是不是泳道上所有的背景都被消除了？各個(gè)電泳條帶是不是完全結(jié)合到縱軸上在同一水平進(jìn)行比較了 我們對(duì)于其他泳道也可以依葫蘆畫(huà)瓢進(jìn)行類(lèi)似的背景排除工作。如果大家覺(jué)得可以使用同樣的標(biāo)準(zhǔn)，即相同的“Rol

19、ling Disk Size”進(jìn)行排除，那么我們可以在“Lane Backgroud Substruction”對(duì)話框中選擇上方的“All Lanes On(same level”選項(xiàng)。然后在“Rolling Disk Size”中填上一個(gè)合適的值，點(diǎn)擊“Done ”按鈕確認(rèn)就可以了。此時(shí)該電泳圖片上所有的泳道都以相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了背景去除。不信你可以自己將鼠標(biāo)點(diǎn)擊其他泳道（比如第8道或第1道），你會(huì)發(fā)現(xiàn)所有泳道的背景均已去除。 7、Quantity One的電泳泳道分析功能-對(duì)比泳道剛才我們已經(jīng)對(duì)電泳圖片上的泳道進(jìn)行了識(shí)別和背景去除。現(xiàn)在我們可以利用Quantity One 提供的泳道對(duì)比功能

20、對(duì)同一張凝膠照片上的不同泳道進(jìn)行對(duì)比，看看每條泳道上電泳條帶的分布情況。泳道對(duì)比：首先將打開(kāi)的電泳照片進(jìn)行前面談到的泳道識(shí)別和去除背景步驟。然后選擇“Lane-Compare Lanes ”命令，鼠標(biāo)變成“藍(lán)色感嘆號(hào)”之后將鼠標(biāo)移動(dòng)到您希望進(jìn)行對(duì)比的泳道上（比如下圖的第3泳道），左鍵點(diǎn)擊，Quantity One 就會(huì)立刻探出一張黑色背景的“Compare Lanes”對(duì)話框。在這個(gè)對(duì)話框中紅色的曲線代表您選擇的泳道的光密度分布曲線。曲線的波峰部分表示位于泳道上的不同電泳條帶；波峰的高低象征電泳條帶光密度值的大小；波峰的寬窄象征電泳條帶的寬度；波峰由左至右表示各個(gè)電泳條帶順著泳道由后向前的分布

21、PHP 代碼:大家請(qǐng)注意這個(gè)紅色曲線。它不僅僅提供給我們關(guān)于泳道上光密度的分布情況，更重要的是在下一步我們對(duì)電泳條帶進(jìn)行定量的時(shí)候，我們將以每個(gè)波峰的曲線下面積作為定量的標(biāo)準(zhǔn). 我們還可以用鼠標(biāo)點(diǎn)擊其他我們感興趣的泳道（比如下圖中第6、9、14泳道），這時(shí)再轉(zhuǎn)到“Compare Lanes”對(duì)話框我們會(huì)發(fā)現(xiàn)Quantity One已經(jīng)幫我們用不同顏色在同一張圖片上繪制出了這4條泳道的對(duì)比圖。是不是非常PP？ 8、Quantity One的電泳條帶分析功能-創(chuàng)建條帶前面我們已經(jīng)識(shí)別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們開(kāi)始研究電泳條帶的問(wèn)題。首先在這里明確兩個(gè)名詞翻譯：“Lane ”指電泳泳道；“Ba

22、nd ”指電泳條帶。在下文中一律使用這兩個(gè)英文名詞來(lái)表示這兩個(gè)意思。電泳條帶的識(shí)別：和前面研究Lane 一樣，首先我們要對(duì)Lane 上的Band 進(jìn)行識(shí)別。識(shí)別方式同樣分為自動(dòng)識(shí)別和人工識(shí)別。自動(dòng)識(shí)別的時(shí)候選擇“Band-Detect Bands.”命令。這時(shí)Quantity One會(huì)自動(dòng)彈出一個(gè)“Detect Bands ”的對(duì)話框（如下圖）。PHP 代碼:第一次用Quantity One的朋友可能會(huì)發(fā)現(xiàn)您的Bands 識(shí)別以后僅僅是畫(huà)出了一條紅色的粗線，而在上面的演示圖片中卻是上下括號(hào)的形式。其實(shí)大家可以在“Band-Band Attributes”選項(xiàng)中設(shè)置Bands 的顯示形式。在下方

23、的“Style”選項(xiàng)卡中選擇“Brackets”就會(huì)將原來(lái)的粗線改為括號(hào)形式了. 在上面的對(duì)話框中，我們可以指定識(shí)別的參數(shù)。如果要自動(dòng)識(shí)別所有Lanes 上的Bands 就鉤選Lands 后面的“All ”選項(xiàng)；如果僅僅想自動(dòng)識(shí)別某一條Lane 上的Bands 就鉤選“One ”，然后在后面的輸入框中填上您想識(shí)別的泳道號(hào)碼；如果僅僅想識(shí)別泳道上部分光密度值最強(qiáng)的Bands，可以在“Bands ”后面的選項(xiàng)中選擇“Limit ”，然后填上相應(yīng)的數(shù)目（比如10）。Quantity One就會(huì)僅識(shí)別該泳道上光密度最大的10條Bands；如果您發(fā)現(xiàn)自動(dòng)識(shí)別的Bands 寬度太窄，圈定Band 的紅色括

24、號(hào)內(nèi)范圍小于黑色的光密度影。此時(shí)可以使用“Lane Width ”命令來(lái)調(diào)整Bands 識(shí)別的寬度。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“Lane Width ”后面的向上箭頭就會(huì)發(fā)現(xiàn)紅色括號(hào)逐漸變寬，最后要求其范圍略為寬過(guò)其包繞的Band影跡； 如果您發(fā)現(xiàn)自動(dòng)識(shí)別功能沒(méi)有識(shí)別您想要的Band 或者誤識(shí)別了您不想要的Band，您還可以使用上面的工具欄進(jìn)行調(diào)解。將您的鼠標(biāo)指向每個(gè)圖標(biāo)，Quantity One 就會(huì)知道彈出一個(gè)黃色的提示信息告訴您這個(gè)按鈕的功能。在此不再繼續(xù)闡述了。9、Quantity One的電泳條帶分析功能-高斯建模與結(jié)果分析現(xiàn)在我們已經(jīng)完成了泳道識(shí)別、背景去除、條帶識(shí)別的任務(wù)。接下來(lái)我們要對(duì)Band

25、s 進(jìn)行一些處理，然后就可以進(jìn)行最終的結(jié)果分析了。高斯建模：大家學(xué)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)后都知道高斯（Gauss）分布是個(gè)什么意思，在此我就不多作解釋了。Quantity One 認(rèn)為一個(gè)理想狀態(tài)的Band 內(nèi)部的光密度分布應(yīng)該也服從高斯曲線的特征，正如前面向大家展示的3D Viewer 中的圖片那樣。在我們?nèi)粘５碾娪居镜乐薪?jīng)常出現(xiàn)幾個(gè)相隔很近的Bands（即分子量很接近的幾個(gè)蛋白或者核酸）在泳道的某個(gè)區(qū)域成串出現(xiàn)。此時(shí)我們很難通過(guò)會(huì)自等高線的辦法精確的描繪出每條Band 獨(dú)立的輪廓。這個(gè)時(shí)候我們就需要對(duì)這些擁擠在一起的Bands 進(jìn)行高斯建模處理。Quantity One能夠依據(jù)高斯曲線的特征，配合有

26、效的背景去除，將各條緊靠在一起、邊界相互融合的Bands 描繪成具有獨(dú)立光密度分布的相互重疊的曲線。如下圖所示，原來(lái)相互融合的22、23兩條Bands 經(jīng)過(guò)高斯建模之后變成了兩個(gè)具有獨(dú)立分布曲線，相互重疊的Bands。PHP 代碼:高斯建模必須建立在有效的泳道背景去除之后。背景去除的方法可以參見(jiàn)我們前面的方法，即通過(guò)“Lane-Lane Backgrouds”的方式進(jìn)行去除背景。去除背景的時(shí)候最好選擇Rolling Disk Size 小一些的方案。這樣背景去除后的光密度分布曲線和高斯建模后的光密度分布曲線才能比較好的吻合。另外高斯建模并不是一個(gè)必須的步驟。它僅僅在出現(xiàn)多條Bands 緊密排列

27、在一起，以至于無(wú)法分辨它們之間的間隔的時(shí)候才最有效。如果Bands 在泳道上松散的分布則可以不使用高斯建模. 那么如何進(jìn)行高斯建模呢？很簡(jiǎn)單！只要執(zhí)行“Band-Gauss Model Bands. ”命令就可以，執(zhí)行后Quantity One回彈出一個(gè)對(duì)話框問(wèn)您要對(duì)那條泳道進(jìn)行高斯建模。請(qǐng)鉤選“One ”，然后再輸入需要建模的泳道代碼就可以了（比如下圖中的第2泳道）；如果選擇了“All ”則對(duì)所有泳道進(jìn)行高斯建模，當(dāng)然建模這么多泳道會(huì)費(fèi)一點(diǎn)時(shí)間了。觀察結(jié)果：執(zhí)行完高斯建模以后使用“Band-Band Information”命令來(lái)觀察結(jié)果。方法是將變成藍(lán)色驚嘆號(hào)的鼠標(biāo)移到剛才已經(jīng)識(shí)別的Ban

28、d 的部位，一個(gè)詳細(xì)的“Band Information”信息框就會(huì)立刻彈出來(lái)（見(jiàn)下圖）。在這幅圖中我們必須注意的是“Trace ”和/或“Gauss Model Trace”，因?yàn)槲覀儎偛判量嗔税胩炀褪菫榱说玫竭@個(gè)數(shù)據(jù)。這個(gè)數(shù)據(jù)表示的就是Band 光密度分布曲線下面積，也就是Quantity One 用來(lái)表達(dá)Band 內(nèi)分子總量的方式。在這個(gè)信息框中還有一些重要信息比如“Mol Wt”（分子量）；“Quantity/Units”等現(xiàn)在還是空白，咱們下以后的分析步驟中將逐漸填滿(mǎn)它們。 PHP 代碼:Quantity One有一點(diǎn)讓人感到很不明白。它的“Trace”和“Gauss Model T

29、race”都是表示曲線下面積的，可是使用的單位是OD*mm；而在另外的等高線定量方法中，同樣是表示某個(gè)區(qū)域面積的單位卻是OD*mm2.下面讓我們回過(guò)頭來(lái)看看高斯建模之后電泳圖片的分析結(jié)果到底發(fā)生了什么變化。首先是一張沒(méi)有進(jìn)行高斯建模的圖片，大家可以看到在這張圖片中的白框部分，第2泳道的第6個(gè)band 的光密度曲線黃色部分并不呈高斯對(duì)稱(chēng)（少了一部分不是？）。這是因?yàn)樗徊糠趾袜徑腂and 相互融合在一起了。 現(xiàn)在再來(lái)對(duì)比一下經(jīng)過(guò)高斯建模后的電泳圖片分析結(jié)果。還是在相同位置，這時(shí)代表第2泳道第6個(gè)Band 的黃色光密度曲線是不是呈完整的高斯對(duì)稱(chēng)了？而且后面的“Gauss Model Trace”

30、也不再是“N.A ”，而變成了“0.717 OD”，對(duì)比上面的“Trace ”=0.693 OD，大家想想為什么要大一些呢？ 10、Quantity One的電泳條帶分析功能-分子量預(yù)測(cè)前面我們和大家學(xué)習(xí)了用Quantity One進(jìn)行電泳條帶定量的基本方法?，F(xiàn)在我們暫時(shí)轉(zhuǎn)移視線來(lái)探討一下另一個(gè)功能，分子量預(yù)測(cè)。這個(gè)功能對(duì)于蛋白質(zhì)而言是分子量預(yù)測(cè)，對(duì)于核酸而言就是核酸大小的預(yù)測(cè)了。下面我們還是以蛋白質(zhì)為例來(lái)學(xué)習(xí)。分子量預(yù)測(cè)：首先大家必須知道的是分子量的預(yù)測(cè)是建立在泳道和條帶都已經(jīng)創(chuàng)建好的基礎(chǔ)上。我們只是人為的為一些泳道上的條帶加上一個(gè)已知的標(biāo)準(zhǔn)，然后通過(guò)不同泳道和條帶之間的對(duì)比繪制回歸曲線，通

31、過(guò)回歸曲線的走向來(lái)預(yù)測(cè)特定條帶上的分子的分子量。當(dāng)然如果我們能夠在一次電泳中多跑幾條不同分子量成分的marker，必然能夠提高我們預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。下面我們談?wù)勅绾尾僮鳌Ｔ谝呀?jīng)創(chuàng)建好泳道和條帶的圖片上，執(zhí)行“Match-Standard ”命令，在彈出的“Select Standards ”選項(xiàng)卡中選擇一個(gè)合適的marker。如果您自己已經(jīng)跑了Marker，那么請(qǐng)選擇“New Standard”創(chuàng)建您自己的marker，然后在彈出的“Standard ”菜單中輸入您的Marker 的分子量。如下圖在“Standard ”中輸入一個(gè)名稱(chēng)，然后在下面的表格中輸入各個(gè)Marker的分子量和名稱(chēng)。 輸入完

32、成以后用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“Type ”下面的小箭頭（上圖鼠標(biāo)指向的位置），然后把變成綠色加號(hào)的鼠標(biāo)移動(dòng)到您的Marker 泳道上相應(yīng)的band。例如上圖中200KD 就移動(dòng)到第15泳道的200KD 的位置，以此類(lèi)推，將每個(gè)Marker 都標(biāo)記上相應(yīng)的數(shù)字。標(biāo)記完成后，Maker泳道上的Bands 就會(huì)變成藍(lán)色。 如果您有多條Marker 泳道，您可以再多表記幾條以提高軟件預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性?，F(xiàn)在我們執(zhí)行“Match-Standard Curve ”，然后用鼠標(biāo)隨便點(diǎn)擊我們想要了解的泳道，Quantity One立刻就會(huì)為我們顯示出一條曲線，傍邊還有一個(gè)小的對(duì)話框“Std.Curve Options for

33、Proteins ”，在這個(gè)對(duì)話框中“Regression Model ”選擇“Point to Point Semi-log”或者“Elder-Southern ”這兩種回歸方式；然后鉤選傍邊的“Show Numerical data of Points”，這時(shí)再看那條曲線上是不是已經(jīng)標(biāo)注了許多數(shù)字？這些數(shù)字就是水平方向上對(duì)應(yīng)的Bands 的分子量了。 11、Quantity One的電泳條帶分析功能-創(chuàng)建定量標(biāo)準(zhǔn)上面說(shuō)明說(shuō)過(guò)，在Band Information中除了“trace ”和“gauss model trace ”以外我們還有幾個(gè)項(xiàng)目沒(méi)有填入數(shù)據(jù)。這些當(dāng)時(shí)未填入的數(shù)據(jù)其實(shí)是“Mol

34、.wt ”和“Quantity/Unit”這2項(xiàng)。剛才我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了如何預(yù)測(cè)分子量，大家現(xiàn)在再用“Band-Band Information”命令看看您感興趣的Band，是不是“Mol.wt ”已經(jīng)被填上數(shù)字了？現(xiàn)在只剩下“Quantity/Unit”，讓我們開(kāi)始學(xué)習(xí)如何測(cè)定具體的定量值（原來(lái)測(cè)定的僅僅是光密度值和Band 之間的物質(zhì)的量的比，而沒(méi)有落實(shí)到具體的實(shí)際數(shù)字）。創(chuàng)建定量標(biāo)準(zhǔn)：所謂創(chuàng)建“定量標(biāo)準(zhǔn)”其實(shí)類(lèi)似于剛才我們?cè)O(shè)置的分子量Marker。只不過(guò)這里我們用已知Band 的物質(zhì)的量做為Marker，就像用5ul 的DL2000跑電泳，每條Band 含50ng 的雙鏈DNA 。具體操作如

35、下：執(zhí)行“Analysis-Quantity Standards ”，在彈出的“Calibration Curve ”對(duì)話框中選擇“Creat New”，在隨后的“Quantity Standards”對(duì)話框中填寫(xiě)一系列相關(guān)信息。重要的信息包括：1. “Units ”：指作為marker 的物質(zhì)的量的單位，例如ng，ug，mg等等。2.“Measure ”：指對(duì)于Maker 和待測(cè)Band 的測(cè)量方式。點(diǎn)擊“Measure ”按鈕后可以選擇“Trace Density ”、“Contour Density ”、“Peak Density ”和“Average Density”。如果您前面的分析

36、采用的是軌跡法定量的話可以選擇“Trace Density ”；如果您采用的是等高線法定量可以采用“Contour Density ”。3.“Select ”：在“Select ”后面有三個(gè)選項(xiàng)，Band、Match、Lane。選中其中一個(gè)選項(xiàng)比如“band ”，然后將變成向上小箭頭的鼠標(biāo)指向您自己跑的Marker 條帶，點(diǎn)擊左鍵，就會(huì)發(fā)現(xiàn)此時(shí)該Band 已經(jīng)變成黃色。您可以多點(diǎn)選幾個(gè)作為Marker 的Bands （至少3個(gè)，多多益善），然后回到“Quantity Standards ”框。這時(shí)框下部的表格變成可填寫(xiě)狀態(tài)，在“Quantity ug ”中填入相應(yīng)的數(shù)字，每個(gè)數(shù)字對(duì)應(yīng)您剛才標(biāo)記的作marker 的Bands。后面的“Dilution factor ”項(xiàng)可暫時(shí)不管；其他兩項(xiàng)“Lane ”和“Match ”主要用來(lái)一次性填入一條泳道上所有的Bands 的標(biāo)記，填寫(xiě)方法類(lèi)似“Band ”?，F(xiàn)在我們?cè)俅问褂谩癇and-Band Information”來(lái)查看我們感興趣的任何泳 道上的條帶，是不是所有的信息都填滿(mǎn)了？包括該 band 的定量也直接給出了實(shí) 際數(shù)字。到此我們的軌跡法定量終于告于一個(gè)段落了。 12、Quantity One 的等高線定量法 看了前面的軌跡定量法大家是不是有些頭暈了？呵呵是有些煩。 不過(guò)大家如 果會(huì)用 Quantity One 提供的“