熒光的簡(jiǎn)介及其應(yīng)用

1、熒光的簡(jiǎn)介及其應(yīng)用【摘要】日常生活中熒光類物品隨處可見，在自然科學(xué)中它也同樣做出了巨大的貢獻(xiàn)。熒光吸收了外界能量后，能發(fā)出不同波長(zhǎng)和不同強(qiáng)度的光，一旦外界能源消失，則熒光也隨之消失。可用熒光這一特性進(jìn)行熒光分析檢測(cè)以及生物探針的標(biāo)記?！娟P(guān)鍵詞】 熒光 熒光分析 DNA 蛋白質(zhì) 【正文】 日常生活中熒光類物品隨處可見，熒光筆，熒光粉，熒光板，熒光燈，這些日常用品在為我們帶來便捷的同時(shí)也給予了我們美的享受。熒光究竟是什么物質(zhì)，它在自然科學(xué)中又有哪些應(yīng)用呢，下面讓我們對(duì)熒光進(jìn)行更深入的探究。一 熒光的簡(jiǎn)介自然界存在這樣一類物質(zhì)，當(dāng)吸收了外界能量后，能發(fā)出不同波長(zhǎng)和不同強(qiáng)度的光，一旦外界能源消失，則這

2、種光也隨之消失，這種光稱為熒光。 外界提供能量的方式有多種，如光照、加熱、化學(xué)反應(yīng)及生物代謝等。根據(jù)激發(fā)光的波長(zhǎng)不同，熒光可分為射線熒光、紫外可見熒光和紅外熒光等。根據(jù)發(fā)射熒光的粒子不同，熒光又可分為分子熒光和原子熒光，由于不同的物質(zhì)其組成與結(jié)構(gòu)不同，所吸收光的波長(zhǎng)和發(fā)射光的波長(zhǎng)也不同。二 熒光的產(chǎn)生 物質(zhì)分子的能級(jí)包括一系列電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。分子吸收能量后，從基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)（這一過程速度很快，大約10-15 s），成為激發(fā)單重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以通過以下幾種途徑釋放能量返回基態(tài)：一 振動(dòng)馳豫 這一過程只能發(fā)生在同一電子

3、能級(jí)內(nèi)，即分子通過碰撞以熱的形式損失部分能量，從較高振動(dòng)能級(jí)下降到該電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)上。由于這一部分能量以熱的形式釋放，而不是以光輻射形式發(fā)出，故振動(dòng)馳豫屬于無輻射躍遷。2 內(nèi)轉(zhuǎn)換 即激發(fā)態(tài)分子將多余的能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，從較高電子能級(jí)降至較低的電子能級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)換也屬于無輻射躍遷。3 熒光 較高激發(fā)態(tài)分子經(jīng)無輻射躍遷降至第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后，仍不穩(wěn)定，停留較短時(shí)間后（約10-8 s，稱作熒光壽命），以光輻射形式放出能量，回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這時(shí)所發(fā)射的光稱為熒光。當(dāng)然也可以無輻射躍遷形式返回基態(tài)。 4 系間竄躍 有些物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振

4、動(dòng)能級(jí)后，有可能經(jīng)過另一個(gè)無輻射躍遷轉(zhuǎn)移至激發(fā)三重態(tài)，這一過程伴隨著自旋方向的改變，稱為系間竄躍。對(duì)于大多數(shù)物質(zhì)，系間竄躍是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋-軌道的強(qiáng)偶合作用，電子自旋方向可以改變，系間竄躍就變得容易了。5 磷光 經(jīng)系間竄躍的分子再通過振動(dòng)馳豫降至激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，停留一段時(shí)間（10-410 s，稱作磷光壽命），然后以光輻射形式放出能量返回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這時(shí)發(fā)出的光稱為磷光（phosphorescence）。由于激發(fā)三重態(tài)能量比激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)能量低，故磷光輻射的能量比熒光更小，即磷光的波長(zhǎng)比熒光更長(zhǎng)。三 熒光的檢測(cè)光源發(fā)出的紫外可見光

5、通過激發(fā)單色器分出不同波長(zhǎng)的激發(fā)光，照射到樣品溶液上，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。樣品發(fā)出的熒光為寬帶光譜，需通過發(fā)射單色器分光后再進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)不同發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度F。由于激發(fā)光不可能完全被吸收，可透過溶液，為了防止透射光對(duì)熒光測(cè)定的干擾，常在與激發(fā)光垂直的方向檢測(cè)熒光（因熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的）。 四 激發(fā)光譜與熒光光譜的形成任何熒光物質(zhì)，都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜。激發(fā)光譜 保持熒光發(fā)射波長(zhǎng)不變（即固定發(fā)射單色器），依次改變激發(fā)光波長(zhǎng)（即調(diào)節(jié)激發(fā)單色器），測(cè)定不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)下得到的熒光強(qiáng)度F（即激發(fā)光波長(zhǎng)掃描）。然后以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，就可

6、得到該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。激發(fā)光譜上熒光強(qiáng)度最大值所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)就是最大激發(fā)波長(zhǎng)，是激發(fā)熒光最靈敏的波長(zhǎng)。物質(zhì)的激發(fā)光譜與它的吸收光譜相似，所不同的是縱坐標(biāo)。熒光光譜 熒光光譜，又稱發(fā)射光譜。保持激發(fā)光波長(zhǎng)不變（即固定激發(fā)單色器），依次改變熒光發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定樣品在不同波長(zhǎng)處發(fā)射的熒光強(qiáng)度F。以發(fā)射波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，得到熒光發(fā)射光譜。熒光發(fā)射光譜上熒光強(qiáng)度最大值所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)就是最大發(fā)射波長(zhǎng)。五 熒光分析法的應(yīng)用（一） 有機(jī)物的熒光分析 由于熒光分析的高靈敏度、高選擇性，使它在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)、藥物分析、環(huán)境檢測(cè)及食品分析等方面有廣泛的應(yīng)用。 芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，在紫

7、外光照射下能產(chǎn)生熒光。因此，熒光分析法可直接用于這類有機(jī)物的測(cè)定，如：多環(huán)胺類、萘酚類、嘌呤類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸及蛋白質(zhì)等，約有200多種。食品中維生素含量的測(cè)定是食品分析的常規(guī)項(xiàng)目，幾乎所有種類的維生素都可以用熒光法進(jìn)行分析。多環(huán)芳烴普遍存在于大氣、水、土壤、動(dòng)植物及加工食品中，大家所熟知的苯并a芘是致癌活性最強(qiáng)的一種，通過萃取或色譜分離后，可采用熒光法進(jìn)行測(cè)定。該方法準(zhǔn)確可靠，測(cè)定最低濃度可達(dá) 0.1 mg/ml。（2） 無機(jī)元素的熒光分析能產(chǎn)生熒光的無機(jī)物較少，對(duì)其進(jìn)行分析通常是將待測(cè)元素與熒光試劑反應(yīng)，生成具有熒光特性的配合物，進(jìn)行間接測(cè)定。目前利用該法

8、可進(jìn)行熒光分析的無機(jī)元素已近70種。常見的有鉻、鋁、鈹、硒、鍺、鎘等及部分稀土元素。例如Al3+與桑色素或8-羥基喹啉的配合物就可產(chǎn)生熒光，從而用于鋁的測(cè)定。有些元素雖不能與有機(jī)試劑形成能產(chǎn)生熒光的配合物，但它可使熒光物質(zhì)的熒光熄滅。例如F-離子在一定pH的溶液中，能從Al3+與桑色素的熒光配合物中奪取Al3+，從而導(dǎo)致熒光配合物的熒光強(qiáng)度降低，其熒光強(qiáng)度與F-離子的濃度成反比，利用這一性質(zhì)可間接測(cè)定樣品中的氟離子含量。六 分子熒光在生命科學(xué)中的應(yīng)用（1） DNA分子熒光探針DNA是生命遺傳的重要物質(zhì)，DNA分子的定量分析、特異識(shí)別，對(duì)基因組學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展具有十分重要的

9、意義。由于生物分子自身的熒光較弱，目前多采用熒光探針法檢測(cè)。熒光探針法較傳統(tǒng)的同位素檢測(cè)快速，重復(fù)性好，用樣量少，無輻射，在DNA自動(dòng)測(cè)序，抗體免疫分析，疾病診斷，抗癌藥物分析等方面已得到廣泛應(yīng)用。DNA熒光探針的靈敏度是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素，因而開發(fā)出更靈敏的熒光探針，同時(shí)避免生物熒光背景的干擾已成為目前研究的熱點(diǎn)。 DNA分子熒光探針可分為吖啶、菲啶類；菁類染料；熒光素和羅丹明類；稀土元素探針和量子點(diǎn)熒光探針。目前，DNA熒光探針要解決的問題是提高靈敏度，增強(qiáng)光穩(wěn)定性，降低合成成本。不同的DNA熒光探針各有優(yōu)缺電，有機(jī)類染料中近紅外染料具有一定的優(yōu)勢(shì)，尤其是近紅外菁染料將會(huì)更多的被合成并

10、應(yīng)用于生物分子的榆測(cè)，其光穩(wěn)定性有待提高。量子點(diǎn)探針作為一個(gè)新興領(lǐng)域，必將受到越來越多的重視。相信不久的將來，隨著新型、性能優(yōu)異的熒光探針的開發(fā)，人類將能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)一些生物過程運(yùn)用多種方法、多種參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)、動(dòng)態(tài)研究，這極大地推動(dòng)基因組學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。（2） 蛋白質(zhì)分子熒光探針 在生物體中，蛋白質(zhì)是必不可少的生命活性物質(zhì)。有關(guān)蛋白質(zhì)的各類研究是目前生命科學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)中共同關(guān)注的課題。近年來在特定蛋白質(zhì)的光學(xué)標(biāo)記方面，尤其是分子小、量子效率高、熒光探針分子設(shè)計(jì)與應(yīng)用方面的研究取得了較大進(jìn)展。但仍存在著許多有待解決的問題，如小分子標(biāo)記對(duì)于細(xì)胞內(nèi)存在的各種復(fù)雜情形而言，其標(biāo)記的特異性目前

11、仍舊具有挑戰(zhàn)性；尚未在真正意義上實(shí)現(xiàn)運(yùn)用多種參數(shù)對(duì)生物活體內(nèi)各類蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)、動(dòng)態(tài)研究?？梢灶A(yù)計(jì)今后相關(guān)研究將會(huì)側(cè)重于以下幾個(gè)方面：第一，合成新型分子熒光探針，提高靈敏度，增強(qiáng)光穩(wěn)定性，降低合成成本，開發(fā)出更多針對(duì)生物活體內(nèi)不同種類蛋白質(zhì)分析檢測(cè)的特異性熒光探針。二，深入研究熒光探針與蛋白質(zhì)的作用方式，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析和特異識(shí)別來探討生命機(jī)理，加深對(duì)生命過程機(jī)理的理解。三，利用激光共聚焦等熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)一些生物過程運(yùn)用多種方法、多種參數(shù)進(jìn)行多層面實(shí)時(shí)觀測(cè)、動(dòng)態(tài)研究，開發(fā)新的、靈敏的、能進(jìn)行活體追蹤和檢測(cè)的分析測(cè)試方法。四，蛋白質(zhì)表達(dá)的變化或異常會(huì)造成疾病的發(fā)生，通過蛋白質(zhì)標(biāo)記物研究疾病機(jī)理，對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)警，防患于未然，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療和早期診斷，同時(shí)開發(fā)針對(duì)各種疾病機(jī)理的高效藥物。七 總結(jié)如今，熒光技術(shù)已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。熒光分析技術(shù)由于它的高靈敏度、高選擇性，使它在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)、藥物分析、環(huán)境檢測(cè)及食品分析等方面有廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，熒光在生命科學(xué)中也發(fā)揮出巨大的作用在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科的有力推動(dòng)與滲透下，隨著新型、性能優(yōu)異的熒光探針的不斷開發(fā)與應(yīng)用，人類將能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生命特質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的探討，進(jìn)而解釋生命的奧秘，極大地推動(dòng)并促進(jìn)生