研究創(chuàng)新型實驗項目計劃 - 內蒙古大學

1、生命科學學院本科生能力提高項目（科研訓練）基金子課題概要申請類別： 指南項目 開放項目 課題名稱： 扁桃體B淋巴細胞分離與純化 教師姓名： 李煜 研究方向： 動物細胞工程 合作指導教師： 李瑤 擬接收本科生年級和人數(shù)： 07或08級生物技術專業(yè)4人左右 研究項目介紹背景知識簡介（或訓練內容）由于單克隆抗體(monoclonal antibody )具有純度高、效價高、特異性強，少或無血清交叉反應等特點，已被廣泛應用于醫(yī)學生物學各領域。隨著分子生物學技術的發(fā)展,尤其是抗體庫技術、鼠抗體人源化改造技術以及近年利用轉基因技術研制完全人源化抗體的突破,為單抗進入臨床治療提供了良好的應用前景。人源化單克

2、隆抗體較鼠源化有許多優(yōu)點，而最顯著的優(yōu)點是可較大范圍的降低抗體注射到人體內后的免疫排斥反應，增加藥物的效價。世界上人源化單克隆抗體的制備大多在傳統(tǒng)單抗基礎上以基因或抗體表面修飾手段來改造抗體，以減少其在人體內的異源性（如嵌合抗體，CDR移植抗體，SDR移植抗體，轉基因小鼠等），而很少有直接以人的漿細胞和瘤細胞融合獲得單抗的的試驗。其主要原因是人體特異性淋巴細胞的獲得，不能像動物那樣簡單。免疫過程和脾細胞的獲得都受到很大限制。本項目擬從人體扁桃體分離純化B淋巴細胞，通過誘導或細胞融合途徑制備B淋巴細胞永生化細胞系，從而進一步探討人源化抗體的體外免疫途徑。探討人源化抗體體外免疫途徑的前提是制備能夠

3、體外培養(yǎng)并長期傳代的B淋巴細胞系，為此分離、純化、培養(yǎng)B淋巴細胞是達到上述目標的重要研究內容。近年來國內外有關上述問題研究報道不是很多，但也取得了一些重要的研究成果。Saito 等發(fā)現(xiàn)扁桃體腺樣體切除術對于哮喘及變應性鼻炎等有治療作用，扁桃體中未分化的B 淋巴細胞 ( CD20 +) 數(shù)量巨大，所占比例為71.2 %，而單個核細胞僅為15. 5 %，因此從扁桃體獲得人源B淋巴細胞無疑是一個成本較低途徑；扁桃體作為次級淋巴器官，不僅含有大量B淋巴細胞，也有T淋巴細胞、漿細胞、上皮細胞、巨噬細胞、朗哥漢細胞等，為得到純化的B淋巴細胞，近年來人們探索了一些卓有成效的方法，如利用E玫瑰花反應原理和用密

4、度梯度離心法去除T淋巴細胞，用EBv轉化B淋巴細胞永生化等。綜上所述，人體扁桃體B淋巴細胞分離及體外培養(yǎng)技術，在人源化抗體制備和免疫學基礎研究中具有重要科學意義，是探索人源化單克隆抗體制備新途徑的基礎工作。1. Xiaocong Yu, Patricia A. McGraw, Frances S.et.al. An optimized electrofusion-based protocol for generating virus-specific human monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2009 July 31.2. Martina

5、Wiesner, Caroline Zentz, Christine Mayr,et.al. Conditional Immortalization of Human B Cells by CD40 Ligation.PLoS ONE.2008; 3(1): 1464. 3. Ling NR. Immunoglobulin production by cultured human lymphocytes .J Immunol Methods, 2000,238, 238 (1-2) :3-15 . 4. Tangye SG, Avery DT,Hodgkin PD. A division-li

6、nked mechanism for the rapid generateon of Ig-secreting cells from human memory B cells .J Immunol, 2003,170, 170 (1) :261-269 . 5. Avery DT, Ellyard JI,Mackay F,et al. Increased expression of CD27 on activated human memory B cells correlates with their commitment to the plasma cell lineage .J Immun

7、ol, 2005,174, 174 (7) :4034-4042 . 現(xiàn)有研究基礎近年來本實驗室開展了胃癌細胞、狂犬病毒單克隆抗體研究工作，查閱了大量有關淋巴細胞分離、純化、細胞融合、融合細胞體外培養(yǎng)、抗體效價檢測等文獻資料。對上述各個技術環(huán)節(jié)的現(xiàn)有方法，經(jīng)過實際應用和不斷修改，具備了一定實際操作基礎，并發(fā)表了階段性研究成果。上述研究為本課題研究工作的開展打下了良好基礎。細胞工程實驗室有開展細胞工程相關研究所需的高檔設備和無菌室，本實驗室已有的儀器設備有：無菌室，CO2培養(yǎng)箱（FORMA ），超凈工作臺（SW-CJ-1D），離心機（LD5-2A），體視顯微鏡（OLYMPUS），倒置相差熒光顯微

8、鏡(NIKON，OLYMPUS)，顯微操作儀(NARISHIGE，LEICA)，電融合儀(BTX)，拉針儀(NARISHIGE，LEICA )，磨管儀(NARISHIGE、LEICA )，微熔爐(NARISHIGE、LEICA )，純水器(石英雙蒸兩臺)，超聲波清洗器（KQ-1500B），高速臺式離心機（FORCE-7），液氮罐、電子天平（PR203），電熱鼓風干燥箱（101C-3B），低溫冰柜，冰箱等，基本具備開展本項研究的實驗條件。研究摘要1. 研究目標本項目旨在尋找人扁桃體B淋巴細胞分離、純化及其鑒定方法，為人源化單克隆抗體制備新方法的建立提供基礎。2. 研究內容1）扁桃體是體內實質性器

9、官，其中的B淋巴細胞集中分布于生發(fā)中心，周圍有結締組織和上皮的包裹，其間有各種類型的細胞混雜在一起，依據(jù)上述組織特性，本研究擬探索研磨、消化、切割擠壓等方法使淋巴細胞從組織中游離，得到純化淋巴細胞的初制材料。2）依據(jù)上皮細胞、巨噬細胞、朗哥漢細胞、成纖維細胞等與B淋巴細胞體積不同的特性，經(jīng)密度梯度離心的方法純化淋巴細胞。3）T淋巴細胞和B淋巴細胞大小相似，密度相近，難以通過密度梯度離心的方法分離兩種細胞。但T淋巴細胞具有E玫瑰花檢驗陽性的特性，由此可以改變T淋巴細胞的沉降率，從而結合密度梯度離心的方法進一步純化細胞懸液中的B淋巴細胞。這種方法成本較低，可能會取得較好的分離效果。4）依據(jù)B淋巴細胞特有表面抗原，分析鑒定細胞的特性和純度。另外通過B淋巴細胞特異性抗原分析和熒光染色，結合細胞流式儀可以進一步分離純化B淋巴細胞，可以作為本相研究的備用