齊墩果酸烏蘇酸積雪草酸護(hù)肝及抗氧化作用的比較研究

1、齊墩果酸烏蘇酸積雪草酸護(hù)肝及抗氧化作用的比較研究        【摘要】     目的研究比較3種五環(huán)三萜化合物齊墩果酸(OA)、烏蘇酸(UA)、積雪草酸(AA)的護(hù)肝及抗氧化作用。方法建立小鼠D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)肝損傷模型，檢測OA、UA、AA對損傷小鼠血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性以及肝組織脂質(zhì)過氧化的影響;運(yùn)用體外自由基清除試驗(yàn)，測定3種化合物對超氧陰離子和羥自由基的清除作用。結(jié)果100 mg

2、3;kg-1 OA、UA、AA均能有效抑制D-GalN/LPS引起的小鼠血清AST及ALT活性的顯著上升;明顯減少肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成;一定濃度3種化合物能有效清除超氧陰離子和羥自由基，且3個(gè)化合物清除自由基能力存在顯著差異。結(jié)論3種五環(huán)三萜化合物OA、UA、AA均具有顯著護(hù)肝和抗氧化活性，且AA、UA的護(hù)肝作用優(yōu)于OA，其機(jī)理可能與其具有更強(qiáng)的清除自由基能力有關(guān)。     【關(guān)鍵詞】  齊墩果酸; 烏蘇酸; 積雪草酸; D-氨基半乳糖/脂多糖; 抗氧化作用    Abstract：Objec

3、tiveTo compare the hepatoprotective and anti-oxidative effects of three pentacyclic triterpenoids, oleanolic acid(OA), ursolic acid(UA) and asiatic acid(AA). MethodsD-GalN/LPS-induced liver injury model was used to evaluate the effects of OA, UA and AA on the activities of serum aspartate aminotrans

4、ferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the level of liver lipid peroxidation in mice. Scavenging activity on superoxide anion and hydroxyl radicals of three compounds were investigated to determine their anti-oxidative effects.ResultsPretreatment with 100 mg·kg-1 OA, UA and AA, dov

5、usly reversed the increase of serum AST and ALT activities and the level of liver lipid peroxidation induced by D-GalN/LPS in mice. OA, UA and AA, at concentrations ranging from 50 to 450 mol·L-1, showed dose-dependent superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activity. In addition, it w

6、as also found that there were differences among three compounds in scavenging activity on free radicals, anti-oxidative and hepatoprotective effects. Conclusion Three pentacyclic triterpenoids, OA, UA and AA, have significant hepatoprotective activity against D-GalN/LPS-induced liver injury in mice.

7、 Moreover, the hepatoprotection and anti-oxidation of UA and AA are stronger than that of OA and the mechanisms might be related to their more powerful scavenging activities on free radicals.Key words：Oleanolic acid (OA); Ursolic acid (UA); Asiatic acid (AA); D-Galactosamine; Lipopolysaccharide; Ant

8、i-oxidation五環(huán)三萜類化合物分布廣泛，資源豐富，毒性較低，具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性，尤其在抗炎、護(hù)肝、抗腫瘤以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面已經(jīng)顯現(xiàn)出令人關(guān)注的藥理特性。其中以齊墩果酸(OA)研究最為清楚，作為抗肝炎藥物亦早已應(yīng)用于臨床。烏蘇酸(UA)為OA的同分異構(gòu)體，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，UA不僅具有OA相同的生物學(xué)作用，而且在防治肝炎、抗腫瘤等方面比OA的作用更強(qiáng)大1，2。積雪草酸(AA)為OA、UA的結(jié)構(gòu)類似物，除具有刺激膠原合成、抗炎、增強(qiáng)認(rèn)知、抗腫瘤3等藥理作用外，我們近期的研究首次發(fā)現(xiàn)其具顯著抗肝損傷作用4。本研究擬運(yùn)用D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)小鼠急

9、性肝損傷和體外自由基清除試驗(yàn)，比較OA、UA及AA的護(hù)肝及抗氧化作用，為更好地開發(fā)利用五環(huán)三萜化合物提供依據(jù)。1 材料與儀器1.1 動(dòng)物ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量1822 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK(蘇)2002-0031。1.2 試劑齊墩果酸，中國藥品生物制品研究所產(chǎn)品;烏蘇酸、積雪草酸，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;聯(lián)苯雙酯(DDB)，北京協(xié)和制藥廠產(chǎn)品。D-氨基半乳糖、脂多糖、黃嘌呤、四唑氮藍(lán)、細(xì)胞色素C、黃嘌呤氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)，Sigma公司產(chǎn)品。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒，南京建成

10、生物工程研究所產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3 儀器Hitachi 7600-020全自動(dòng)生化分析儀，日立公司產(chǎn)品;7520分光光度計(jì)，上海分析儀器廠產(chǎn)品; Biofuge Primo R 冷凍離心機(jī)，Kendro 公司產(chǎn)品;電熱恒溫水浴鍋，北京市醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。2 方法2.1 D-GalN/LPS急性肝損傷模型的建立小鼠分6組：正常組、D-GalN/LPS損傷組、OA、UA、AA組和陽性對照組。正常組和損傷組小鼠以0.2 ml·(10 g)-1體質(zhì)量生理鹽水連續(xù)灌胃5 d，OA、UA、AA組以及陽性對照組分別以100 mg·kg-1 3種化合物及200 mg·

11、;kg-1DDB同樣方式灌胃;第6天正常組小鼠按0.2 ml·(10 g)-1腹腔注射生理鹽水，其余組小鼠腹腔注射600 mg·kg-1 D-GalN;1 h后，除正常組小鼠腹腔注射0.2 ml·(10 g)-1生理鹽水外，其它各組腹腔注射LPS(10 g·kg-1)，同時(shí)小鼠給予禁食不禁水。LPS注射12 h后，取血，分離血清，待測血清ALT、AST活力。處死小鼠后，取部分肝組織，制備肝組織勻漿，待測脂質(zhì)過氧化水平。2.2 酶活力的測定分離得到的各組小鼠血清，全自動(dòng)生化分析儀測定血清ALT及AST活性。2.3 脂質(zhì)過氧化水平測定制備的肝組織勻漿，妥巴比

12、法測定脂質(zhì)過氧化水平。2.4 超氧陰離子清除實(shí)驗(yàn)利用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶氧自由基發(fā)生系統(tǒng)測定化合物對超氧陰離子的清除率5。實(shí)驗(yàn)分為11組：對照組，OA 三個(gè)劑量組(50，150，450 mol·L-1)，UA的三個(gè)劑量組(50，150，450 mol·L-1)，AA 三個(gè)劑量組(50，150，450 mol·L-1 )，陽性對照組。在3 ml的10 mmol·L-1 KH2PO4-KOH緩沖液 (pH 7.4)中加入相應(yīng)濃度3種化合物、100 mol·L-1黃嘌呤及0.02 U·ml-1黃嘌呤氧化酶，加入100 mol·L-

13、1四唑氮藍(lán)，于25條件下孵育5 min，于550 nm處測定吸光值，以100 mol·L-1 SOD作為陽性對照。超氧陰離子清除率計(jì)算公式：(AControl-ADrug) /AControl×100 %，A=A0 min-A5 min。2.5 羥自由基清除試驗(yàn)利用CuSO4/細(xì)胞色素C自由基發(fā)生系統(tǒng)檢測化合物對羥自由基的清除率6。實(shí)驗(yàn)分組同“2.4”項(xiàng)。在3 ml的0.15 mmol·L-1磷酸緩沖液(含100 mol·L-1 維生素C、100 mol·L-1 CuSO4及100 mol·L-1 細(xì)胞色素C，pH 7.4)中加入相應(yīng)

14、濃度3種化合物，反應(yīng)體系于25 中孵育90 min，于550 nm處測定吸光值，以60 mol·L-1 維生素E作為陽性對照。羥自由基清除率計(jì)算公式：(AControl-ADrug) /AControl100 %，A=A0 min-A90 min。2.6 統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行單因素方差分析(one way analysis of variance, one way ANOVA)，各處理組的組間差異采用SNK-q(Student Newman Keuls-q)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。3 結(jié)果3.1 對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷酶活力及肝組織脂質(zhì)過氧化水平的影響由表1可看出，D-GalN/L

15、PS損傷小鼠血清ALT及AST活性急劇升高，而預(yù)先予100 mg·kg-1的3種化合物灌胃的小鼠血清ALT及AST活性均顯著低于損傷組，OA、UA、AA對血清ALT活性升高的抑制率分別為71.6 %，88.4%和 100 %;對血清AST活性升高的抑制率分別68.3%，84.7%和95.6%。比較3種化合物的護(hù)肝作用，發(fā)現(xiàn)其降酶效果存在顯著差異：AA對損傷小鼠血清ALT酶活的抑制作用強(qiáng)于UA，而UA強(qiáng)于OA(P<0.01); AA和UA對損傷小鼠血清AST酶活的抑制作用強(qiáng)于OA(P<0.01)。小鼠D-GalN/LPS損傷后，肝組織脂質(zhì)過氧化水平升高為正常小鼠的2.9倍，

16、表明產(chǎn)生了肝組織的氧化損傷。而與損傷小鼠相比，預(yù)先以3種不同化合物灌胃給藥的小鼠肝組織MDA水平有不同程度下降，OA、UA、AA對損傷引起的肝組織脂質(zhì)過氧化水平升高的抑制率分別為63.5 %，83.8 %和91.5 %，其中AA、UA抑制作用強(qiáng)于OA(P<0.01)。3.2 對超氧陰離子的清除作用對超氧陰離子的清除試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，3種化合物對超氧陰離子有明顯的清除作用，并且隨著濃度的增加，其清除作用隨之加強(qiáng)。比較相同濃度不同化合物對超氧陰離子的清除作用發(fā)現(xiàn)，AA、UA的清除能力超過了相同濃度的OA，450 mol·L-1AA對超氧陰離子的清除率(55.5%)及UA(49.

17、4 %)與同濃度OA(40.4%)相比均有顯著差異(P<0.01)。表1 OA、UA、AA對小鼠酶活力及肝組織脂質(zhì)過氧化的影響表2 OA、UA、AA對超氧陰離子的清除作用3.3 對羥自由基的清除作用由表3可知，150及450 mol·L-1 3種化合物對羥自由基具有顯著清除作用。比較其對羥自由基的清除能力發(fā)現(xiàn)，3種化合物對羥自由基清除能力有顯著差異， OA，UA、AA(450 mol·L-1)對羥自由基的清除率分別為41.8 %、50.9 %和63.9 %，清除能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)锳A>UA>OA(P<0.01)。表3 OA、UA、AA對羥自由基的清

18、除作用4 討論D-GalN/LPS肝損傷是篩選護(hù)肝藥、研究藥物作用原理最常用的肝損傷模型7。本研究運(yùn)用D-GalN/LPS小鼠急性肝損傷試驗(yàn)研究比較3種五環(huán)三萜化合物OA、UA、AA的護(hù)肝作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種化合物對D-GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷酶活力升高均有顯著抑制作用，且3種化合物降酶效果存在顯著差異：降低血清ALT活性能力強(qiáng)弱的順序?yàn)锳A>UA>OA;降低血清AST活性能力強(qiáng)弱的順序?yàn)锳A，UA>OA;同時(shí)檢測了肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的量，發(fā)現(xiàn)3種化合物均能顯著減少M(fèi)DA的生成，表明其均具有抗氧化作用，且其抗氧化能力大小順序?yàn)锳A，UA>OA，該

19、結(jié)果提示，3種化合物護(hù)肝效果存在顯著差別，且該差異可能與它們的抗氧化能力強(qiáng)弱不同有關(guān)。運(yùn)用自由基清除試驗(yàn)，進(jìn)一步比較3種化合物的體外抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)，一定濃度3種化合物對自由基具有顯著清除作用，且不同化合物的自由基清除率存在顯著差異，其清除自由基能力強(qiáng)弱的順序與在體抗氧化的順序一致(AA，UA>OA)。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，該類化合物護(hù)肝作用強(qiáng)弱與其抗氧化作用之間可能存在相關(guān)關(guān)系。OA護(hù)肝、解毒作用已得到肯定，其機(jī)制認(rèn)為是多重的，由于化學(xué)結(jié)構(gòu)存在活潑的雙鍵、羥基、羧基官能團(tuán)，如與毒物結(jié)合易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，達(dá)到解毒目的;能對抗自由基，抑制脂質(zhì)過氧化物，有膜穩(wěn)定作用8;增加肝細(xì)胞谷胱甘肽酶活力，直

20、接抑制轉(zhuǎn)氨酶活性，抑制P4502E1的表達(dá)和活性，并且使肝細(xì)胞DNA及蛋白質(zhì)合成速率明顯增高，有促進(jìn)肝組織修復(fù)的作用。UA和OA分子組成完全相同，二者為同分異構(gòu)體，在保肝、護(hù)肝機(jī)制可能與OA有相似之處，并且其特色可能重在對抗自由基、抑制脂質(zhì)過氧化物1,9。而AA和OA分子結(jié)構(gòu)非常類似，比OA多2個(gè)羥基，推測，羥基數(shù)目的增加是AA抗氧化能力增強(qiáng)的重要原因之一。分析三者結(jié)構(gòu)的差異，可以認(rèn)為分子構(gòu)象的不同以及羥基數(shù)目的差別可能是該類化合物抗氧化和保護(hù)肝細(xì)胞能力強(qiáng)弱不同的重要原因。鑒于五環(huán)三萜類化合物的優(yōu)勢以及OA護(hù)肝、解毒等方面比較成熟的臨床用途，而AA及UA在抗氧化和保護(hù)肝細(xì)胞方面均顯著優(yōu)于OA，

21、AA及UA護(hù)肝、解毒等功效值得關(guān)注，有望開發(fā)成為功能強(qiáng)大的護(hù)肝新藥。    【參考文獻(xiàn)】  1 Liu H. Oleanolic acid and ursolic acid: Research perspectivesJ. J. Ethnopharm. 2005, 100(1-2): 92.2 Saravanan R, Viswanathan P, Pugalendi KV, et al. Protective effect of ursolic acid on ethanol-mediated experimental liver damage in ratsJ. Life Sci. 2006, 78(7): 713.3 林 娜, 高 靜, 方春錢, 等. 積雪草酸與化療藥物聯(lián)用抗腫瘤效應(yīng)的初步研究J. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008, 18(6): 494.4 Gao J, Chen J, Tang XH, et al. Mechanisms underlying mitochondrial protection of Asia