熒光探針定量PCR檢測(cè)HBV-DNA

1、熒光探針定量PCR檢測(cè)HBV-DNA賴(lài)宏芳付曉野董玉琳鄧志軍 摘要本文采用熒光探針定量(FQ-PCR)法準(zhǔn)確定量檢測(cè)HBV-M陽(yáng)性標(biāo)本中的HBV-DNA數(shù)量。結(jié)果顯示：HBeAg(+)組(32份)的陽(yáng)性率為100%，HBV-DNA拷貝數(shù)范圍在105109/ml之間。HBeAb(+)組(47份)的陽(yáng)性率為23.4%，HBV-DNA拷貝數(shù)范圍在103105.7/ml之間；HBsAb(+)組(37份)的陽(yáng)性率為2.7%，HBV-DNA拷貝數(shù)為105/ml。以上44例HBV-DNA陽(yáng)性拷貝數(shù)范圍在103109/ml之間。HBeAg(+)組血清中HBV-DNA含量(107.091顯著高于HBeAb(+)

2、組(104.71)和HBsAb(+)組(105)。結(jié)果表明：HBV-DNA的FQ-PCR檢測(cè)較常規(guī)PCR更具有較高的靈敏度和特異性，且定量準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，能避免PCR后處理污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性，可反映HBV真實(shí)感染和低復(fù)制狀態(tài)。結(jié)合HBV-DNA含量測(cè)定判斷HBV病毒復(fù)制狀態(tài)，對(duì)臨床診斷、治療及判斷預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。 關(guān)鍵詞乙型肝炎病毒熒光探針定量-聚合酶鏈反應(yīng)脫氧核糖核酸 常規(guī)PCR技術(shù)因存在擴(kuò)增產(chǎn)物污染、所用染色劑溴化乙啶是強(qiáng)烈致癌物，以及臨床不能準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)。為此，本文采用FQ-PCR法，以克服常規(guī)PCR的不足。對(duì)116例ELISA法檢測(cè)的乙肝血清標(biāo)志物(HBV-M)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行H

3、BV-DNA測(cè)定，以探討FQ-PCR技術(shù)在HBV病原體感染診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。 材料和方法 一、材料和儀器116份經(jīng)HBV-M檢測(cè)陽(yáng)性的血清，HBV-M ELISA試劑盒，廈門(mén)新創(chuàng)科技公司提供。FQ-PCR試劑盒，中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供。檢測(cè)儀器為PE7700自動(dòng)熒光PCR儀(美國(guó)PE公司)。 二、檢測(cè)方法FQ-PCR法是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)記熒光發(fā)光分子和一個(gè)熒光淬滅分子的雙標(biāo)記探針，前者標(biāo)記5端，后者標(biāo)記在3端。完整的探針在激光激發(fā)下，發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光被淬滅分子全部吸收，從而無(wú)熒光。PCR擴(kuò)增中Taq酶在鏈延長(zhǎng)過(guò)程中可以通過(guò)自身的53核酸外切酶活性而降解，與模板

4、結(jié)合的特異性熒光探針(切口平移效應(yīng))2，使得熒光發(fā)光分子從探針上切下，而與熒光淬滅分子分開(kāi)，從而在激光激發(fā)下產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光。這種熒光隨著PCR擴(kuò)增過(guò)程而動(dòng)態(tài)性增強(qiáng)。FQ-PCR儀通過(guò)全過(guò)程動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可以得到每一個(gè)樣品實(shí)際擴(kuò)增曲線以找到PCR擴(kuò)增的對(duì)數(shù)期，比較標(biāo)準(zhǔn)樣品(單位：拷貝數(shù)/ml)的對(duì)數(shù)期，得出每一樣品特定模板DNA的起始拷貝數(shù)/ml。 定量范圍為01010/ml，定量準(zhǔn)確度為100%。 本法操作是用常規(guī)的堿裂解法從血清中提取HBV-DNA。各反應(yīng)管放入PE7700自動(dòng)熒光檢測(cè)儀，按下列條件擴(kuò)增：93 2 min預(yù)變性，然后按照9345 s，55120 s，共經(jīng)40個(gè)循環(huán)后，由儀器軟件

5、自動(dòng)分析計(jì)算出定量結(jié)果。 定量結(jié)果采用計(jì)算對(duì)數(shù)平均值的方法來(lái)計(jì)算HBV-DNA平均拷貝數(shù)，遇有陰性結(jié)果，不參加平均值的統(tǒng)計(jì)。其單位采用：拷貝數(shù)/ml。 結(jié)果 116例HBV-M陽(yáng)性標(biāo)本用FQ-PCR檢測(cè)HBV-DNA含量詳見(jiàn)附表：檢測(cè)HBV-DNA拷貝數(shù)范圍在103109/ml之間。 附表FQ-PCR檢測(cè)的HBV-DNA含量(s) 組別 例數(shù) 陽(yáng)性數(shù)(%) HBV-DNA (以指數(shù)表示) P值(與1比) 1.HBsAg+/HBeAg+/HBcAb+ 32 32 (100) 7.091.03 2.HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+ 47 11 (23.4) 4.71 0.01 3.HBsA

6、b+ 37 1 (2.7) 5 0.01 注：各組拷貝數(shù)范圍為：101.96s/ml HBeAg(+)組HBV-DNA拷貝數(shù)范圍在105109/ml之間，其HBV-DNA含量顯著高于HBeAb(+)組與HBsAb(+)組 HBeAb(+)組11例HBV-DNA拷貝數(shù)范圍在103107/ml之間。 HBsAb(+)組只檢出1例HBV-DNA拷貝數(shù)為105/ml。 討論 熒光探針定量PCR技術(shù)融匯PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，根據(jù)PCR反應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，獲得DNA模板的準(zhǔn)確定量結(jié)果。該技術(shù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在完全閉管的狀態(tài)下進(jìn)行，無(wú)需PCR后處理和冗長(zhǎng)的電泳、

7、紫外或染色檢測(cè)，解決了常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)不能準(zhǔn)確定量及擴(kuò)增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽(yáng)性，操作繁復(fù)以及強(qiáng)烈致癌物溴化乙啶對(duì)操作人員的危害和污染環(huán)境等問(wèn)題，成為常規(guī)PCR的更新?lián)Q代技術(shù)。 本文采用的FQ-PCR試劑盒用中國(guó)藥品生物制品檢定所的靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試，靈敏度可達(dá)到0.01 fg/ml，相當(dāng)于2.5個(gè)HBV Dane顆粒/ml，其靈敏度亦高于常規(guī)PCR的102103個(gè)拷貝/ml。 FQ-PCR可以準(zhǔn)確定量出01010個(gè)拷貝的病原體，定量范圍極寬，具有重要的臨床診斷價(jià)值。以乙肝為例，HBsAg強(qiáng)陽(yáng)性的血清中可測(cè)出高達(dá)105109病毒顆粒，隨著治療的進(jìn)程，病毒拷貝數(shù)逐步減少，部分病人完全轉(zhuǎn)陰，多數(shù)病人在H

8、BsAg轉(zhuǎn)陰后HBV DNA仍呈陽(yáng)性。據(jù)此，可建立乙肝治愈與否的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。而PCR定性測(cè)定難以得出治愈與否的判定。 FQ-PCR法采用實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，可以得到每一個(gè)樣品實(shí)際擴(kuò)增曲線以找到PCR擴(kuò)增對(duì)數(shù)期，以標(biāo)準(zhǔn)品比較，所得值與原始模板數(shù)量呈線性相關(guān)，定量準(zhǔn)確率較高。有資料顯示：常規(guī)PCR在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，在實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，故其結(jié)果很難重復(fù)3。此外常規(guī)PCR法的定量是針對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行的，其平臺(tái)效應(yīng)大為干擾了PCR的原始數(shù)量和終產(chǎn)物之間的相關(guān)性，使定量準(zhǔn)確度難以提高4。 本文結(jié)果顯示：標(biāo)志感染期HBeAg(+)組：FQ-PCR定量的平均拷貝數(shù)為107/ml，標(biāo)志恢復(fù)期

9、HBeAb(+)和HBsAg(+)組：FQ-PCR定量的平均拷貝數(shù)為104.7/ml和105/ml，以上結(jié)果表明：FQ-PCR可以清楚反映乙肝患者的病程變化情況及真實(shí)反映HBV的感染和復(fù)制情況。進(jìn)而用于臨床診斷、治療和療效觀察，將有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。 賴(lài)宏芳（昆明市延安醫(yī)院650051） 付曉野（昆明市延安醫(yī)院650051） 董玉琳（昆明市延安醫(yī)院650051） 鄧志軍（中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心） 參考文獻(xiàn) 1張復(fù)春，吳婉芬，董惠卿，等中華傳染病雜志，1997；15(1)24 2Holland P M,Abramson R D,Watson R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5to 3exonuclease a