重組人生長(zhǎng)激素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Surv

1、重組人生長(zhǎng)激素對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Survivin和 Caspase?3表達(dá)的影響                      作者：郭耀強(qiáng) 白宏英 曾志磊 劉海濤 方李鴻【摘要】  目的 觀察重組人生長(zhǎng)激素(recombinant human growth hormone，rhGH)對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)存活素(Survivin)和半胱氨酰

2、天冬氨酸特異性蛋白酶?3 (Caspase?3)表達(dá)的影響。方法 采用大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型,將72只健康雄性SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組和治療組。分別于模型制作成功后1、3、5、7 d處死大鼠,采用連續(xù)切片免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Survivin 和Caspase?3的表達(dá)。結(jié)果 治療組Survivin表達(dá)較對(duì)照組明顯增多,而Caspase?3表達(dá)較對(duì)照組顯著減少。結(jié)論 腦缺血/再灌注損傷早期應(yīng)用rhGH可上調(diào)Survivin表達(dá)及下調(diào)Caspase?3表達(dá),抑制神經(jīng)元的凋亡。 【關(guān)鍵詞】  腦缺血/再灌注損傷;重組人生長(zhǎng)激素;Survivin;Cas

3、pase?3;細(xì)胞凋亡【Abstract】 Objective To observe the effects of recombinant human growth hormone(rhGH) on the expressions of Survivin and Caspase?3 in rats with cerebral ischemia?reperfusion injury. Methods The model of focal cerebral ischemia?reperfusion injury was made by occluding middle cerebral arter

4、y(MCA)for 2 hours and reperfusion.Seventy?two healthy male SD rats were randomly divided into the sham?operated group, control group and treatment group. And immunohistochemistry technique was used to detect the condition of the expression of Survivin and Caspase?3 in three groups respectively.Resul

5、ts The expression of Survivin was markly increased and Caspase?3 was obviously decreased in treatment group compared with control group. Conclusion It is demonstrated that treatment with recombinant human growth hormone could induce expression of Survivin and suppress the activity of Caspase?3 in ne

6、urons within the cerebral cortex. It can inhibit the neuronal apoptosis.【Key words】 Cerebral ischemia?reperfusion injury; Recombinant human growth hormone;Survivin;Caspase?3;Apoptosis重組人生長(zhǎng)激素(recombinant human growth hormone，rhGH)在1986年通過基因工程技術(shù)合成，與人生長(zhǎng)激素(human growth hormone, hGH)結(jié)構(gòu)相同，目前主要用于治療生長(zhǎng)激素缺乏性侏

7、儒癥、燒傷、抗炎及不育癥等。近年來,國(guó)內(nèi)外研究表明,生長(zhǎng)激素具有減輕大腦缺血缺氧引起的損傷,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活等作用1?4,但機(jī)制還不十分清楚。目前,尚未有生長(zhǎng)激素對(duì)腦缺血/再灌注損傷后Survivin、Caspase?3表達(dá)影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用rhGH觀察大鼠腦缺血/再灌注損傷后缺血側(cè)大腦皮質(zhì)Survivin、Caspase?3表達(dá)的變化,探討其神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制,為臨床治療探索新的方法及思路。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康雄性SD大鼠72只,體質(zhì)量250280 g,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前禁食12 h,禁水4 h。隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組(腦缺血/再灌

8、注+生理鹽水組)、治療組(腦缺血/再灌注+rhGH組)3組,每組24只。1.2 主要試劑和藥物 重組人生長(zhǎng)激素注射液由長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn); Survivin多克隆抗體及Caspase?3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ生物技術(shù)公司。1.3 大鼠腦缺血/再灌注模型的制備及處理 線栓法大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型采用改良的Longa5線栓法,大腦中動(dòng)脈(MCA)阻斷2 h后,將尼龍栓線拔出,實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插線外,其余步驟與對(duì)照組和治療組相同。參照 Zea Longa 5級(jí)4分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)5，評(píng)分為13分的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入選。治療組在腦缺血/再灌注模型成功后開始頸部皮下注射重組人生

9、長(zhǎng)激素0.1 U?kg?1? d?1,1次/24 h。對(duì)照組注射同樣劑量生理鹽水,注射時(shí)間與次數(shù)同治療組。1.4 組織切片和免疫組化檢測(cè) 分別于腦缺血/再灌注后1、3、5、7 d處死大鼠,以4%多聚甲醛灌注固定,石蠟包埋和切片。常規(guī)脫蠟、水化,取缺血側(cè)大腦皮質(zhì),按試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作,DAB顯色,光鏡下觀察,胞漿出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性著色。1.5 免疫組化結(jié)果分析 在光鏡下觀察Survivin 和Caspase?3免疫反應(yīng)的結(jié)果,并采用Biosens Digital Imaging System v1.6(上海山富科學(xué)儀器有限公司) 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像定量分析。Survivin 和Cas

10、pase?3免疫組化染色標(biāo)記強(qiáng)度用灰度值表示,比較各組陽(yáng)性區(qū)平均灰度值的差異。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理,各組數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,用LSD?t法進(jìn)行兩兩比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。2 結(jié)果2.1 大腦皮質(zhì)Survivin表達(dá)的變化 假手術(shù)組大鼠腦組織中Survivin僅有少量表達(dá),對(duì)照組13 d達(dá)到高峰,隨后逐漸降低,至7 d仍有較高水平的表達(dá),較假手術(shù)組顯著升高;治療組較對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。2.2 大腦皮質(zhì)Caspase?3表達(dá)的變化 Caspase?3在假手術(shù)組少量表達(dá),對(duì)照組13

11、d達(dá)到高峰,后開始下降,至7 d時(shí)仍高于假手術(shù)組;治療組較對(duì)照組顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。表1 各組Survivin表達(dá)的變化(陽(yáng)性區(qū)平均灰度表示)注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較,P<0.05;與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)比較, P<0.05表2 各組Caspase?3表達(dá)的變化(陽(yáng)性區(qū)平均灰度表示)注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較,P<0.05;與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)比較,P<0.053 討論腦缺血/再灌注損傷是一種常見的、復(fù)雜的病理生理過程。有研究表明6,腦缺血后隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),缺血側(cè)皮層凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加,主要分布在梗死灶邊緣區(qū),48 h凋亡細(xì)

12、胞達(dá)到高峰,說明凋亡在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用。半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteing aspartate specific protease, Caspase)特別是Caspase?3處于凋亡過程的下游階段,是凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶,及時(shí)抑制凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中的關(guān)鍵蛋白酶,挽救缺血半暗帶區(qū)尚未凋亡的神經(jīng)元是腦血管疾病治療的關(guān)鍵。而Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員,是至今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白之一,既能抑制細(xì)胞凋亡,又能誘導(dǎo)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的有絲分裂及生長(zhǎng)周期時(shí)相,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和血管生成等7?8。腦缺血/再灌注損傷能促使缺血側(cè)腦組織Survivin強(qiáng)烈持續(xù)高表達(dá)。我們

13、實(shí)驗(yàn)觀察到腦缺血/再灌注損傷后Survivin表達(dá)升高,13 d達(dá)到高峰,隨后逐漸降低,至7 d仍有較高水平的表達(dá),提示Survivin在腦缺血/再灌注損傷早期即參與抗凋亡的復(fù)雜生理過程。應(yīng)用rhGH干預(yù)后Survivin表達(dá)顯著升高,說明腦缺血/再灌注損傷早期應(yīng)用rhGH,可以增加Survivin 的合成和分泌。同時(shí)發(fā)現(xiàn),腦缺血/再灌注損傷后Caspase?3表達(dá)升高,至再灌注13 d達(dá)到高峰,隨后開始下降,至7 d時(shí)仍高于假手術(shù)組,結(jié)果與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致,表明腦缺血/再灌注損傷與細(xì)胞凋亡存在密切的聯(lián)系,參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過程。有研究認(rèn)為9?10,生長(zhǎng)激素可能通過NF?kappa

14、B 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生抗凋亡蛋白Bcl?2 和BAG?1,促進(jìn)細(xì)胞存活。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2,心肌缺血/再灌注24 h后生長(zhǎng)激素組心肌細(xì)胞的凋亡以及凋亡相關(guān)基因Caspase?3、Cleaved Caspase?3蛋白陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)均明顯少于心肌缺血/再灌注組。我們研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用rhGH干預(yù)后Caspase?3表達(dá)較對(duì)照組顯著下降,提示rhGH可能直接或間接通過抑制Caspase?3活性,抑制神經(jīng)元的凋亡。另有研究表明11,Survivin可能直接抑制Caspase?3和Caspase?7的活性,阻斷凋亡信號(hào)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,從而抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用。綜上所述,我們認(rèn)為腦缺血/再灌注損傷早期

15、應(yīng)用rhGH治療,可上調(diào)Survivin表達(dá)，下調(diào)Caspase?3表達(dá),抑制神經(jīng)元凋亡,但其具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道目前尚不清楚,有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Azcoitia I, Perez?Martin M, Salazar V, et al. Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampusJ.Neurobiology of Aging,2005,26(5):697?703.2 黃瑞健，李萌，孫培吾.生長(zhǎng)激素對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注后心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Caspase?3 Cleaned

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