聚合酶鏈反應(yīng)在幽門(mén)螺桿菌感染中的新進(jìn)展

1、聚合酶鏈反應(yīng)在幽門(mén)螺桿菌感染中的新進(jìn)展    關(guān)鍵詞： 聚合酶鏈反應(yīng) 幽門(mén)螺桿菌感染 發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）至今已有十多年，在這十多年期間對(duì)Hp的研究進(jìn)展飛速，已從細(xì)胞水平逐漸深入到分子水平?，F(xiàn)在認(rèn)為Hp是胃炎，消化性潰瘍的主要致病因素，而且與胃癌有密切關(guān)系。Hp本身的螺形，鞭毛結(jié)構(gòu)及其分泌的細(xì)菌毒素，空泡毒素，尿素酶，粘蛋白酶，過(guò)氧化氫酶，磷脂酶，熱休克蛋白，低分子趨化性蛋白質(zhì)粘附素等都與其致病相關(guān)。診斷Hp感染已從傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)，免疫學(xué)手段發(fā)展到分子生物學(xué)方法，尤其是通過(guò)分析Hp核酸，已清楚Hp的部分核苷酸序列，

2、這為聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）用于Hp研究創(chuàng)造了條件。本文就近年有關(guān)PCR在Hp研究中的應(yīng)用作一綜述。1PCR原理PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特DNA片段的技術(shù)，有關(guān)它的原理許多文獻(xiàn)已有詳細(xì)介紹，這里只作簡(jiǎn)述PCR的每次擴(kuò)增循環(huán)包括三步，第1步為變性，在高溫下把雙鏈靶DNA拆開(kāi)；第2步，在較低的溫度下使引物與靶DNA互補(bǔ)；第3步在中間溫度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延長(zhǎng)，典型的PCR包括3050循環(huán)，如此重復(fù)循環(huán)，使被擴(kuò)增的靶核苷酸以幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增，在PCR操作中，有幾點(diǎn)必須考慮。選擇引物長(zhǎng)度以1530個(gè)堿基為宜，太短特異性不佳

3、，太長(zhǎng)不增加特異性而合成費(fèi)用增加。引物中應(yīng)盡量避免單高重復(fù)的核苷酸結(jié)構(gòu)，同時(shí)還要考慮引物本身的物理特性，避免經(jīng)物自身退火。反應(yīng)的退火溫度慎重選擇，溫度高可提高特異性，但敏感性隆低，溫度低則反之。2引物選擇2.1尿素酶基因核苷酸Hp分泌大量的尿素酶，該酶是導(dǎo)致哺乳動(dòng)物對(duì)Hp產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要抗原，可能是Hp的重要致病因子之一，因此許多學(xué)者采用尿素酶核苷酸序列中的部分片段作為引物。Clayton等報(bào)告了Hp尿素酶基因（ureA和tureB）的核苷酸序列，篩選到ureA和tureB兩個(gè)亞單位，并測(cè)得了它們的核苷酸序列。目前有代表性的采用以尿素酶部分核苷酸順序?yàn)橐飳?duì)的有：Clayton采用一對(duì)18個(gè)

4、堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導(dǎo)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物為411個(gè)堿基對(duì)。其他學(xué)者都是以Clayton報(bào)告的Hp尿素酶基因的部分核苷酸序列為依據(jù)而設(shè)計(jì)PCR的引物。Courcoux等選擇尿一紗酶C基因中的一段294bp作PCR反應(yīng)。2.216S rRNA核苷酸順序所有細(xì)菌的rRNAs根據(jù)其大小分為三種：含120個(gè)核苷酸的5s rRNA；含1600個(gè)核苷酸的16S rRNA及含3000個(gè)核苷酸的23S rRNA。分析細(xì)菌16s rRNA現(xiàn)已作為細(xì)菌分類(lèi)的一個(gè)指標(biāo)。大量研究證明，Hp的部分16s rRNA與彎曲菌屬細(xì)菌顯著不同，目前采用以16S rRNA部分核苷酸順序?yàn)橐锏闹饕蠬o等，采用一對(duì)20個(gè)

5、堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導(dǎo)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物為109個(gè)堿基對(duì)。有些學(xué)者用PCR拉增Hp及與其相類(lèi)似微生物的16s rRNA，以此來(lái)識(shí)別H.pylori，H.mustelac和 H.canis。2.3編碼Hp特6kD蛋白質(zhì)的核苷酸O'Toole等報(bào)告Hp提取物中大量的26000蛋白質(zhì)，作者提出此蛋白質(zhì)是Hp特異蛋白質(zhì)，并分析編碼該蛋白質(zhì)核苷酸序列。Hammar等以此為依據(jù)，設(shè)計(jì)一對(duì)23個(gè)堿基的寡核苷酸鏈為引物，特異引導(dǎo)拉增后的DNA產(chǎn)物為298個(gè)堿基對(duì)。2.4其它Valentine等從基因庫(kù)中選出1.9kd的DNA片段作為探針，與19株Hp反應(yīng)都為陽(yáng)性，與32種306株其它細(xì)菌均無(wú)

6、反應(yīng)，其特異性為98.7，假陽(yáng)性是由于載體污染。由此作者從1.9kdDNA中的已知288個(gè)堿基片段中選出一對(duì)20個(gè)寡核苷酸鏈為引物，其特異引導(dǎo)擴(kuò)增后DNA產(chǎn)物為203個(gè)堿基對(duì)。縱觀(guān)不同學(xué)者選出的引物，這些引物都能特異地以Hp的DNA為模板，擴(kuò)增Hp的部分核苷酸，而不引導(dǎo)擴(kuò)增其它細(xì)菌的核苷酸。3應(yīng)用3.1臨床診斷自從成功分離出Hp以來(lái)，由于Hp感染在臨床上的重要性，迫切需要一個(gè)快速敏感檢測(cè)檢測(cè)標(biāo)本的方法，學(xué)者們?cè)诓粩嗵剿鞲鞣N診斷Hp感染的方法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法由于細(xì)菌生長(zhǎng)要求高，死亡或菌量過(guò)少，則常規(guī)方法難以檢出，其它方法如同位素標(biāo)記的二氧化碳呼氣試驗(yàn)，費(fèi)用貴，快速尿素酶試驗(yàn)由于制劑標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，消

7、化道其它一些細(xì)菌也產(chǎn)生尿素酶，使該方法的特異性受到影響，檢測(cè)抗Hp抗體方法簡(jiǎn)易，但很難區(qū)分是否為近期感染，隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，最近有些實(shí)驗(yàn)室采用PCR技術(shù)診斷Hp感染，取得滿(mǎn)意結(jié)果，Ho等采用16s rRNA的部分核苷酸序列為引物，其引物不引導(dǎo)拉增與Hp的16S rRNA十分相近的H.cinaedi，H.mustelac，H.hepaticus和產(chǎn)生琥珀酸沃林氏菌。檢測(cè)10份已知Hp陽(yáng)性的病理切片都為陽(yáng)性，另外4份胃粘膜活檢標(biāo)本符合已知結(jié)果并且能檢測(cè)到不能培養(yǎng)的Hp圓球體的DNA，進(jìn)一步測(cè)試從豬，狒狒和猴胃中分離的細(xì)菌，并用內(nèi)部探針與擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物雜交，提示從這些動(dòng)物中分離的細(xì)菌都為

8、Hp。Engstrand等選用的16s rRNA引物順序與Ho者不同，作者采用了反向轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，先利用反轉(zhuǎn)錄酶合成RNA，然后再擴(kuò)增cDNA。其敏感性比常規(guī)PCR提高2550倍，可檢測(cè)到2個(gè)細(xì)菌，檢測(cè)15份標(biāo)本，14份標(biāo)本與呼氣試驗(yàn)和培養(yǎng)相同，該方法的特異性為100，Nguycn等用該方示檢測(cè)口腔齒斑標(biāo)本，18例Hp陽(yáng)性病人中有7例陽(yáng)性，7例未感染Hp病人中，口齒斑未測(cè)到Hp，該結(jié)果提示口腔很可能是Hp除胃以外體內(nèi)另一居留地，這也可能是有些病人抗Hp治療后復(fù)發(fā)的原因之一。Clayton等采用urcA基因的部分核苷酸序列為引物，與50株已知Hp反應(yīng)全部為陽(yáng)性，與產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌，空腸彎曲菌，

9、結(jié)腸彎曲菌及螺旋菌屬（Helicobacter）中另一產(chǎn)尿素酶的細(xì)菌H.mustelae反應(yīng)都為陰性。作者除了直接檢測(cè)胃粘膜外還檢測(cè)了石蠟包埋病理切片，效果較理想。臺(tái)灣學(xué)者設(shè)計(jì)了重疊PCR。作者選用了兩對(duì)以尿素酶基因的部分核苷酸序列為引物，當(dāng)?shù)谝粚?duì)引物的PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)，將其拉擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物再進(jìn)行第2對(duì)引物的PCR循環(huán)，其敏感可提高100倍，而無(wú)假陽(yáng)性。作者分析了兩例擴(kuò)增后DNA產(chǎn)物的部分核苷酸序列，在183個(gè)堿基對(duì)中與已報(bào)道的尿素酶基因序列有98的同源性。Hammar等采用了編碼Hp特異蛋白質(zhì)的部分核苷酸序列為引物，27例胃粘膜標(biāo)本中，19例PCR陽(yáng)性，而在所有PCR陽(yáng)性標(biāo)本中只有15例培養(yǎng)陽(yáng)性，另外唾液杯本有9例陽(yáng)性。Valcntinc等還檢測(cè)了胃液標(biāo)本，在13例胃粘膜活檢陽(yáng)性標(biāo)本中，有11例胃液標(biāo)本陽(yáng)性，而采集胃液比采集胃粘膜方便，只需鼻胃管即操作，對(duì)那些不易做胃鏡的病人和兒童可能是一個(gè)