實驗6——可溶性蛋白質(zhì)的測定

1、精選課件1實驗六：可溶性蛋白質(zhì)的測定實驗六：可溶性蛋白質(zhì)的測定（考馬斯亮藍（考馬斯亮藍G-250法）法）1實驗原理實驗原理 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈料結(jié)合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅紅色色，最大光吸收在，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質(zhì)結(jié)；當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)楹虾笞優(yōu)榍嗌嗌?，蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-色素絡(luò)合物在色素絡(luò)合物在595nm波長下有最大光吸收。其吸光值與蛋白質(zhì)含波長下有最大光吸收。其吸光值與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。精選課件22. 適用范圍與特點適

2、用范圍與特點 該法是該法是1976年年Bradford建立，試劑配制簡單建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法（勞里法）還高法（勞里法）還高4倍，可測定微克級蛋白倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為01000g/mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。 該法的不足是當?shù)鞍踪|(zhì)含量過高時，線性關(guān)該法的不足是當?shù)鞍踪|(zhì)含量過高時，線性關(guān)系較差，重復(fù)性也較差，同時染料很容易結(jié)合到系較差，重復(fù)性也較差，同時染料很容易結(jié)合到比色皿上，給實驗結(jié)果造成一定誤差。比色皿

3、上，給實驗結(jié)果造成一定誤差。精選課件33. 實驗材料、儀器與試劑實驗材料、儀器與試劑材料：材料：豆芽豆芽儀器：儀器：可見分光光度計，分析天平，容量瓶，可見分光光度計，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度試管，研缽，漏斗，移液管，具塞刻度試管，研缽，漏斗，鐵架臺，玻璃棒。鐵架臺，玻璃棒。試劑：試劑：考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250，無水乙醇，磷酸，無水乙醇，磷酸，牛血清蛋白。牛血清蛋白。精選課件4試劑配制：試劑配制：考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250試劑：試劑：稱取稱取0.1000g考馬斯考馬斯亮藍亮藍G-250，溶于，溶于50mL95%乙醇中，加入乙醇中，加入85%磷酸磷酸100mL，用蒸餾水定容至，

4、用蒸餾水定容至1000mL。標準蛋白質(zhì)溶液（標準蛋白質(zhì)溶液（100g/mL）：）：稱取稱取0.0100g牛血清蛋白（牛血清蛋白（BSA），溶于），溶于100mL蒸蒸餾水中。餾水中。精選課件54. 實驗步驟實驗步驟（1）樣品處理：）樣品處理： 準確稱取準確稱取5g豆芽于研缽中，充分研磨豆芽于研缽中，充分研磨后轉(zhuǎn)移至后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，靜置容量瓶中，靜置20min后過后過濾，棄去初濾液后備用。濾，棄去初濾液后備用。精選課件6（2）標準曲線的繪制）標準曲線的繪制 123456BSA（mL）00.20.40.60.81水（水（mL）10.80.60.40.20蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量（g）0204

5、06080100精選課件7 取取6支支10mL具塞試管，按上表加入試劑具塞試管，按上表加入試劑，混合均勻后，向各管中加入，混合均勻后，向各管中加入5mL考馬斯亮考馬斯亮藍藍G-250溶液，稀釋至刻線溶液，稀釋至刻線10mL（則蛋白質(zhì)則蛋白質(zhì)濃度分別為濃度分別為0、2、4、6、8、10g/mL ），），搖勻，放置搖勻，放置5min后于后于595nm波長下比色。以波長下比色。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。制標準曲線。精選課件8（3）樣品的測定）樣品的測定 另取另取3支支10mL具塞試管，分別吸取樣具塞試管，分別吸取樣品溶液品溶液0.6mL

6、，各加入，各加入5mL考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250溶液，稀釋至刻線溶液，稀釋至刻線10mL，充分混合，充分混合，放置放置5min后于后于595nm波長下比色，測定吸波長下比色，測定吸光度，并通過標準曲線查得蛋白質(zhì)含量。光度，并通過標準曲線查得蛋白質(zhì)含量。精選課件95. 結(jié)果計算結(jié)果計算 蛋白質(zhì)含量（蛋白質(zhì)含量（%）=CV2V0 mV1 100式中：式中： C從標準曲線上查得的蛋白質(zhì)濃度，從標準曲線上查得的蛋白質(zhì)濃度，g/mL V0樣品溶液的總體積，樣品溶液的總體積，mL V1測定時加樣量，測定時加樣量，mL V2測定時定容體積，測定時定容體積，mL m 樣品的質(zhì)量，樣品的質(zhì)量，g精選課件10

7、6. 注意事項注意事項 （1）考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德）考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，反應(yīng)快速，并且穩(wěn)定，無法用華力結(jié)合，反應(yīng)快速，并且穩(wěn)定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。自然衰老脫落即可無礙。精選課件11 （2）考馬斯亮藍有）考馬斯亮藍有G-250和和R-250兩種。兩種。 蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合在結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。內(nèi)保持穩(wěn)定。 考馬斯亮藍考馬斯亮藍R-250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但可以被洗脫下去，所以可用來對較緩慢，但可以被洗脫下去，所以可用來對電泳條帶染色。電泳條帶染色。精選課件12 （3）不可使用石英比色皿（因不易洗去染）不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用玻璃比色皿，使用后立即用少色），可用玻璃比色皿，使用后立即用少量量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。的乙醇蕩洗，以洗去染色。 （4）H+濃度是影響線性關(guān)系的主要因素，濃度是影響線性關(guān)系的主要因素，控制好顯色液的控制好顯色