-HDN實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告(新版)

1、臨床輸血與檢驗(yàn)創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)二級(jí)學(xué)院：檢驗(yàn)學(xué)院 教研室：臨床檢驗(yàn)學(xué)實(shí)驗(yàn)名稱母嬰Rh血型不合的新生兒溶血病檢查的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)專業(yè)：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)層次：本科年級(jí)：2009小班：課題組主要成員姓名性別學(xué)號(hào)備注王千慧女？林日娟女10203070229鐘曉女10203070230陳遠(yuǎn)曉女10203070232盧雪如女217盧宇東男10203070？周 杰男10203070？朱虹亮男233周偉澤男10203070？新生兒溶血病是由于母嬰血型不合，胎兒紅細(xì)胞進(jìn)入母體循環(huán)致使母體產(chǎn)生了相應(yīng)的IgG類抗體。該抗體作用于胎兒紅細(xì)胞而引起的同種被動(dòng)免疫性疾病。HDN可引起嬰兒貧血、黃疸、水腫、肝脾腫大，嚴(yán)重者可導(dǎo)致膽紅素腦病

2、，引起新生兒死亡或智力發(fā)育障礙。因此，對(duì)HDN進(jìn)行早期、準(zhǔn)確的診斷有重要意義。新生兒溶血病的患兒血清學(xué)檢測(cè)主要是“三項(xiàng)試驗(yàn)”，即：直接抗球蛋白試驗(yàn)(DAT)；血清游離抗體測(cè)定試驗(yàn)；新生兒紅細(xì)胞抗體釋放。但由于微柱凝膠技術(shù)利用分子篩效應(yīng)和親和效應(yīng)，紅細(xì)胞抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，經(jīng)離心，便可檢測(cè)血型、不完全抗體及作交叉配血試驗(yàn)，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、敏感且易于判讀等優(yōu)點(diǎn)，所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要采用微柱凝膠試驗(yàn)和直接、間接抗人球蛋白試驗(yàn)以及相關(guān)的輔助檢查來對(duì)母嬰Rh血型不合的新生兒溶血病作出診斷。 一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）標(biāo)本、試劑及器材標(biāo)本：靜脈血試劑：微柱凝膠試驗(yàn)【抗人球蛋白凝膠微柱卡：含有抗人球蛋白（抗

3、IgG+C3），可用于檢測(cè)IgG類不完全抗體（間接抗球蛋白試驗(yàn)），IgG類不完全抗體（或）補(bǔ)體致敏紅細(xì)胞（直接抗球蛋白試驗(yàn)）】抗人球蛋白試驗(yàn)【5%篩檢紅細(xì)胞（試劑紅細(xì)胞，用于間接抗人球蛋白試驗(yàn)）、抗球蛋白試劑盒（商品試劑，用于直接抗人球蛋白試驗(yàn)）、IgG包被的紅細(xì)胞、生理鹽水】器材：微柱凝膠試驗(yàn)【微量吸樣槍、微柱凝膠檢測(cè)卡專用離心機(jī)】抗人球蛋白試驗(yàn)【試管、記號(hào)筆、試管架、滴管、乳膠吸頭、吸量管、洗耳球、載玻片、離心機(jī)、顯微鏡、濾紙】（二）主要實(shí)驗(yàn) 產(chǎn)前檢查微柱凝膠試驗(yàn) （1）檢測(cè)血型1.將受檢者紅細(xì)胞（不用洗滌）配成1%生理鹽水懸液，向已標(biāo)記好的特異性凝膠微柱卡的微管反應(yīng)腔內(nèi)加50L。2.立即

4、與1000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10分鐘，觀察結(jié)果3.觀察及判斷血型結(jié)果：陽性：對(duì)照管細(xì)胞沉淀在管底，檢測(cè)管凝集塊在膠上或膠中。陰性：對(duì)照管和檢測(cè)管的細(xì)胞沉淀均在管底。實(shí)驗(yàn)失?。簩?duì)照管細(xì)胞在膠上或膠中，重新試驗(yàn)。4.報(bào)告方式：Rh(D)血型陰性/陽性（2）篩檢和鑒定不完全抗體1.取篩檢紅細(xì)胞或譜細(xì)胞懸液（1紅細(xì)胞生理鹽水懸液）各50L，分別加入標(biāo)記好的微管反應(yīng)腔中。2.然后分別立即加入受檢血清25L。3.將已加好反應(yīng)物的凝膠卡放入37度孵育15min。  4.取出凝膠卡立即以1000r/min水平離心10min，觀察結(jié)果。5.觀察及判斷血型結(jié)果：同血型檢測(cè)。6.報(bào)告方式：篩檢試驗(yàn)

5、陽/陰性。間接抗人球蛋試驗(yàn)1.加血請(qǐng)：分離父親或母親（胎兒則取羊水血型物質(zhì)），取兩滴置于標(biāo)記好的小試管中。2.滴加5%篩檢紅細(xì)胞1滴于小試管中，混勻。3.溫育：37度溫育30-60min。4.離心：1000r/min離心1min。 產(chǎn)后檢查 微柱凝膠試驗(yàn) （1）檢測(cè)血型1.將受檢者紅細(xì)胞（不用洗滌）配成1%生理鹽水懸液，向已標(biāo)記好的特異性凝膠微柱卡的微管反應(yīng)腔內(nèi)加50L。2.立即與1000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10分鐘，觀察結(jié)果3.觀察及判斷血型結(jié)果：陽性：對(duì)照管細(xì)胞沉淀在管底，檢測(cè)管凝集塊在膠上或膠中。陰性：對(duì)照管和檢測(cè)管的細(xì)胞沉淀均在管底。實(shí)驗(yàn)失?。簩?duì)照管細(xì)胞在膠上或膠中，重新試驗(yàn)。4.報(bào)告方式：

6、Rh(D)血型：（2）篩檢和鑒定不完全抗體1.取篩檢紅細(xì)胞或譜細(xì)胞懸液（1紅細(xì)胞生理鹽水懸液）各50L，分別加入標(biāo)記好的微管反應(yīng)腔中。2.然后分別立即加入受檢血清25L。3.將已加好反應(yīng)物的凝膠卡放入37度孵育15min。  4.取出凝膠卡立即以1000r/min水平離心10min，觀察結(jié)果。5.觀察及判斷血型結(jié)果：同血型檢測(cè)。6.報(bào)告方式：篩檢試驗(yàn) 陽/陰性。間接抗人球蛋試驗(yàn)1.加血請(qǐng)：分離父親或母親血清（胎兒的則取羊水血型物質(zhì)），取兩滴置于標(biāo)記好的小試管中2.滴加5%篩檢紅細(xì)胞1滴于小試管中，混勻。3.溫育：37度溫育30-60min。4.離心：以1000r/min離心

7、1min5.觀察：觀察是否有溶血和凝集，并記錄結(jié)果產(chǎn)前檢查微柱凝膠試驗(yàn)直接抗人球蛋試驗(yàn)1.洗滌紅細(xì)胞：徹底懸浮細(xì)胞，用鹽水洗滌5次。最后一次洗滌后，棄掉全部鹽水，將試管邊緣鹽水用濾紙吸干。2.加抗球蛋白：按試劑說明加最適稀釋度抗人球蛋白血清1滴，充分混合。3.離心：以1000r/min離心1min4.觀察：輕輕懸浮細(xì)胞，觀察是否有溶血或凝集，有溶血或凝集為陽性，否則為陰性。5.復(fù)核：陰性者應(yīng)加IgG包被的紅細(xì)胞1滴，離心并觀察結(jié)果：凝集，表示陰性結(jié)果可靠。不凝集，表示試驗(yàn)無效，必須重做。（三）輔助實(shí)驗(yàn) 5.觀察：是否有凝塊和溶血，并記錄結(jié)果。 產(chǎn)后檢測(cè)可疑Rh 等其他血型系統(tǒng)血型不合應(yīng)在出生后

8、盡早為好。微柱凝膠試驗(yàn) （1）檢測(cè)血型1.將父親或母親或嬰兒紅細(xì)胞（不用洗滌）配成1%生理鹽水懸液，向已標(biāo)記好的特異性凝膠微柱卡的微管反應(yīng)腔內(nèi)加50L。2.立即與1000轉(zhuǎn)每分鐘，離心10分鐘，觀察結(jié)果。3.觀察及判斷血型結(jié)果：陽性：對(duì)照管細(xì)胞沉淀在管底，檢測(cè)管凝集塊在膠上或膠中。陰性：對(duì)照管和檢測(cè)管的細(xì)胞沉淀均在管底。實(shí)驗(yàn)失?。簩?duì)照管細(xì)胞在膠上或膠中，重新試驗(yàn)。4.報(bào)告方式：Rh(D)血型陰性/陽性（2）篩檢和鑒定不完全抗體1.取篩檢紅細(xì)胞或譜細(xì)胞懸液（1紅細(xì)胞生理鹽水懸液）各50L，分別加入標(biāo)記好的微管反應(yīng)腔中。2.然后分別立即加入受檢血清25L。3.將已加好反應(yīng)物的凝膠卡放入37度孵育1

9、5min。  4.取出凝膠卡立即以1000r/min水平離心10min，觀察結(jié)果。5.觀察及判斷血型結(jié)果：同血型檢測(cè)。6.報(bào)告方式：篩檢試驗(yàn) 陽/陰性。直接抗人球蛋試驗(yàn)1.洗滌紅細(xì)胞：徹底懸浮細(xì)胞，用鹽水洗滌5次。最后一次洗滌后，棄掉全部鹽水，將試管邊緣鹽水用濾紙吸干。2.加抗球蛋白：按試劑說明加最適稀釋度抗人球蛋白血清1滴，充分混勻。3.離心：1000r/min離心1min。4.觀察：輕輕懸浮細(xì)胞，觀察是否有溶血或凝集，有溶血為陽性，否則為陰性。5.復(fù)核：陰性者應(yīng)加IgG包被的紅細(xì)胞1滴，離心并觀察結(jié)果：凝集：表示陰性結(jié)果可靠。不凝集：表示試驗(yàn)無效，必須重做。（三）輔助實(shí)

10、驗(yàn)（母親及剛出生疑有溶血胎兒或嬰兒）1.流式細(xì)胞儀檢查血常規(guī)，包括血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)2.血涂片檢查細(xì)胞形態(tài)：尤其要觀察紅細(xì)胞是否有溶血及凝塊形成。3. 膽紅素測(cè)定、羊水膽紅素含量測(cè)定：膽紅素氧化酶法測(cè)定總膽紅素和結(jié)合膽紅素，特異性高，手工操作簡(jiǎn)便快捷，也適合自動(dòng)化生化分析儀操作。（四）研究?jī)?nèi)容與方法的技術(shù)路線 （以線路圖的形式簡(jiǎn)要展示）產(chǎn)前檢查血型血清學(xué)檢查常規(guī)檢查產(chǎn)婦及其丈夫R h 血型D抗原鑒定產(chǎn)婦血清的不規(guī)則抗體篩選及篩選陽性者效價(jià)檢測(cè)胎兒的血型物質(zhì)，確定胎兒血型（微柱凝膠試驗(yàn)、間接抗人球蛋試驗(yàn)）外周血常規(guī)檢查血紅蛋白、血涂片檢查、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)

11、織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)膽紅素測(cè)定、羊水膽紅素含量測(cè)定判斷：Rh血型陽性或陰性產(chǎn)后檢查血型血清學(xué)檢查常規(guī)檢查產(chǎn)婦及其丈夫R h 血型D抗原鑒定產(chǎn)婦血清的不規(guī)則抗體篩選及篩選陽性者效價(jià)檢測(cè)嬰兒的血清，確定胎兒血型（微柱凝膠試驗(yàn)、直接抗人球蛋試驗(yàn)）外周血常規(guī)檢查血紅蛋白、血涂片檢查、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)膽紅素測(cè)定、羊水膽紅素含量測(cè)定判斷：Rh血型陽性或陰性二、 近五年參考文獻(xiàn)（參照檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床雜志的投稿要求）1 蘭炯采,劉景漢,馬紅麗,等.新生兒溶血病( HDN) 免疫血液學(xué)試驗(yàn)推薦方案J.中國(guó)輸血雜志,2012,2(25):95-100.2 宋寧,陳靜

12、嫻,李宏.新生兒溶血病檢測(cè)/蘭炯采,贠中橋,陳靜嫻輸血免疫血液學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:45-573 潘紀(jì)春.莊遠(yuǎn).PAN Ji-chun.ZHUANG Yuan .新生兒溶血病血清學(xué)檢查分析J.科學(xué)技術(shù)與工程2010,10(5)4 楊珊.新生兒溶血病血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析J.海南醫(yī)學(xué).2009.20(l)139-1415 盧磊,劉燕.微柱凝膠技術(shù)在新生兒溶血病檢測(cè)中的應(yīng)用J .中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生.2010.48(13)6楊秀麗.紅細(xì)胞直接抗球蛋白試驗(yàn)陽性Rh血型鑒定方法J.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2011,32(14):1609-1610.7 徐 瑋. 新生兒溶血病免疫血液學(xué)檢測(cè)進(jìn)展J. 吉林醫(yī)學(xué).2013, 34(12): 2339-2340. 三、 設(shè)計(jì)創(chuàng)新及存在問題傳統(tǒng)的試管法抗球蛋白檢查方法在手工操作中受到血清與紅細(xì)胞比例、離心速度和時(shí)間等因素的干擾，操作過程中需反復(fù)洗滌紅細(xì)胞。結(jié)果判斷人為影響因素較多，重復(fù)性較差；而且在洗滌過程中由于抗原和抗體之間的親和力較弱，抗體易被洗脫掉，易出現(xiàn)假陰性。微柱凝膠技術(shù)是建立在傳統(tǒng)血型血清學(xué)基礎(chǔ)上的一項(xiàng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是通過調(diào)節(jié)凝膠的濃度來控制凝膠間隙的大小，利