植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告光合色素的提取、理化性質(zhì)分離、吸收光譜及含量的測(cè)定學(xué)號(hào)：134120171姓名：王曉蓮學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)、班級(jí)13 生物科學(xué) C 班實(shí)驗(yàn)課程名稱：植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教師及職稱：李忠光開(kāi)課學(xué)期：2015 至2016學(xué)年下學(xué)期填報(bào)時(shí)間：2016 年4月2日云南師范大學(xué)教務(wù)處編印光合色素的提取、理化性質(zhì)分離、實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)名稱吸收光譜及含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)間實(shí)驗(yàn)室睿智三 4281實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1）掌握光合色素的提取方法以及了解有關(guān)的理化性質(zhì)。（ 2）掌握光合色素的分離方法以及了解有關(guān)的吸收光譜。（ 3）掌握用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素含量的方法2 實(shí)驗(yàn)原理光合色素的提取與理化性質(zhì)光合色

2、素能溶于具有一定極性的有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇等。提取液中無(wú)任何電子受體，因此可以觀察熒光現(xiàn)象。離體葉綠素在有氧氣和光照條件下，發(fā)生光氧化作用，結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成加氧葉綠素等產(chǎn)物。葉綠素是一種雙羧酸酯， 可以發(fā)生皂化反應(yīng)。葉綠素分子中Mg2+與仆啉環(huán)結(jié)合不穩(wěn)定，可以被 H+、Cu2+、Zn2+等離子所取代。 光合色素的分離與吸收光譜光合色素能溶于具有一定極性的有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、 分子結(jié)構(gòu)、極性、溶解度、支持物對(duì)它們的吸附力等不同，因而分配系數(shù)不同，故彼此可以分開(kāi)。葉綠素的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)光有很強(qiáng)的吸收，主要是紅光和藍(lán)紫光。光合色素含量的測(cè)定混合液中的兩個(gè)或多各組分，只要

3、它們的光譜吸收峰不互相重疊，仍然可以根據(jù) Lambert-Beer 定律（ A = k L C ）求出各組分含量。 Lambert 定律： A = k L；Beer 定律 A = k C。葉綠素 a、b 在 80%丙酮溶液中的 Amax分別為 663nm、645nm，由此得出：見(jiàn)推導(dǎo)過(guò)程Ca = 12.7 A663 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 4.68 A663C= 8.02 A663+ 20.20 A645a+bA663= C a.k a1 + C b.k b1A645= Cb.k b2 + C a.k a2由于 K 是一個(gè)常數(shù)，而A 可以通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)出，故求二元一

4、次方程組可得到此公式。k比吸收系數(shù)。即溶劑和波長(zhǎng)不變的情況下，當(dāng)物質(zhì)的濃度(C) 為1g/L(0.1%) ，比色皿的直徑 ( 光徑，L) 為 1cm時(shí)所測(cè)出的吸光度即為比吸收L系數(shù)。故其單位為：g.cm摩爾吸收系數(shù)。 即溶劑和波長(zhǎng)不變的情況下， 當(dāng)物質(zhì)的濃度 (C) 為 1mol/L ，比色皿的直徑 ( 光徑， L) 為 1cm 時(shí)所測(cè)出的吸光度即為摩爾吸收系數(shù)。故其單位為：3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料Lmol.cm（1）材料鮮植物葉片、丙酮、碳酸鈣、石英砂、20%KOH 甲醇溶液、苯、新自來(lái)水、 50%醋酸、醋酸銅、啟動(dòng)劑、80%丙酮（ 2）實(shí)驗(yàn)設(shè)備試管、濾紙、研缽、玻璃棒、錐形瓶、剪刀、移液管、洗耳

5、球、燒杯、漏斗、離心機(jī)、便攜式葉綠素測(cè)定儀、分光光度計(jì)、天平、離心管、滴管4實(shí)驗(yàn)步驟光合色素的提取與理化性質(zhì)（ 1）光合色素的提?。?將植物葉片洗凈并用濾紙洗干，取 1/2 片葉片，放入研缽中并加入少許 CaCO3 和石英砂及 5 ml 丙酮，充分研磨，再加入 10 ml 丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過(guò)濾于三角瓶中，待用。（ 2）觀察熒光現(xiàn)象： 與光線垂直的方向觀察色素顏色。（ 3）光破壞作用： 1ml 色素提取液于室內(nèi)， 1ml 于太陽(yáng)光下， 30min 后觀察顏色變化。（4）皂化反應(yīng)： 取一支試管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液 1ml，搖勻，再加入苯 2.5ml，輕

6、輕搖動(dòng)，沿試管壁慢慢加入自來(lái)水 1ml，輕輕搖動(dòng)后觀察，注意觀察整個(gè)過(guò)程顏色的變化。（5）取代反應(yīng)： 取一支試管，加入 3ml 色素，逐滴加入 50%醋酸直至溶液變?yōu)辄S褐色。倒出一半，加入少許醋酸銅粉末，酒精燈上加熱，與另一半比較顏色的差異。II 光合色素的分離與吸收光譜（ 1）光合色素的提?。?將植物葉片洗凈并用濾紙洗干，取 1/3 片葉片，放入研缽中并加入少許 CaCO3 和石英砂及 5 ml 丙酮，充分研磨，再加入 10 ml 丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過(guò)濾于三角瓶中，待用。（ 2）光合色素分離： 剪取適當(dāng)長(zhǎng)度和寬度的濾紙條 用上行紙層析法分離色素 啟動(dòng)劑：石油醚：丙酮：苯 =10：2

7、：1（ 3）吸收光譜的測(cè)定光合色素的吸收光譜 ：取色素溶液 1 mL ，加入丙酮 3 mL ，搖勻后在分光光度計(jì)上 400 到 700 nm 處每隔 10 nm 進(jìn)行掃描。各色素的吸收光譜： 上述層析出的 34 種色素，分別剪下后溶于 3 mL 丙酮中，按上述方法掃描。III 光合色素含量的測(cè)定方法一：快速測(cè)定法由于葉綠素 a、b 在 652nm 處有共同吸收， k = 34.5 L g-1. cm-1?？芍苯佑帽銛y式葉綠素測(cè)定儀測(cè)定植物葉片的葉綠素含量，最后濃度單位為mg/dm2方法二 : 分光光度計(jì)法色素提?。?將上述植物葉片洗凈并用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取已知的葉圓片0.05g 左右，加入少許

8、 CaCO3 和石英砂及 80%丙酮 2ml ，充分研磨，轉(zhuǎn)入離心管中（離心機(jī)使用），再用 5ml 80%丙酮洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中， 平衡， 5000rpm 離心 10min, 記錄上清液體積，取 1ml 稀釋到 4ml。測(cè)定： 以 1cm 比色皿分別測(cè)定A663、A645。使 A 控制在 0.1 0.8 之間。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析光合色素的提取與理化性質(zhì)一層：淺黃綠色(1)皂化反應(yīng)：溶液分為三層二層：淺綠色三層：深綠色輕輕搖晃過(guò)程中：第一層由淺綠色逐漸變?yōu)辄S綠色第二三層逐漸變?yōu)橐粚?，深綠色在第一層下面出現(xiàn)一層油滴層原因 :葉綠素是一種由葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成甲

9、醇和葉綠醇及葉綠酸鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開(kāi)(2)熒光現(xiàn)象的觀察用肉眼可以觀察到葉綠素提取液在直射光照射下，反射光為藍(lán)綠色，透射光為深紅色原因：葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)， 激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時(shí)可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光；反射光呈藍(lán)綠色是因?yàn)槿~綠素對(duì)藍(lán)綠色光的吸收很少，而對(duì)于其他顏色光的吸收很多，所以會(huì)呈現(xiàn)出藍(lán)綠色的反射光II 光合色素的分離與吸收光譜光合色素的分離如圖所示將涂有葉綠體色素的濾紙放入層析液后，葉綠體色素隨層析液沿濾紙向上推進(jìn)，在濾紙上分為四個(gè)條帶，其顏色由下至上分別為黃綠色、藍(lán)綠色、黃色、橙黃色，由資料可知由下至上依

10、次為葉綠素b、葉綠素 a、葉黃素、胡蘿卜素；其中藍(lán)綠色條帶最寬，黃綠色條帶次之，黃色、橙黃色條帶較細(xì)，說(shuō)明葉綠體中含量較多的是葉綠素a 和葉綠素 b。吸收光譜（附圖）III 光合色素含量的測(cè)定方法一：快速測(cè)定法序號(hào)1234平均值含量 （ mg/dm 2）31.630.531.627.630.3方法二 : 分光光度計(jì)法波長(zhǎng) (nm)663645含量（ A）0.2070.077C a = 12.7 A663 2.69 A 645Ca=2.42mg/LC b = 22.9 A645 4.68 A 663Cb=0.79mg/LC a+b=8.02A663+20.20A645Ca+b=3.12mg/L各

11、葉綠素含量：V=10mlW=0.05g由公式： Chl content=CV (mg.g -1 FW)WChla=484mg.g-1 FWChl b=158mg.g-1 FW6、思考題1、為什么在皂化反應(yīng)中只能用20%KOH 甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？因?yàn)樯夭荒苋苡谒?甲醇其實(shí)在這里只是當(dāng)做溶劑使用，化學(xué)中有“相似相容”，色素是有機(jī)物所以只能溶于有機(jī)溶劑2、光合色素的吸收光譜對(duì)我們理解光合作用有何意義？葉綠體色素的吸收光譜的來(lái)年改革峰值分別在 430nm 左右和 660nm 左右。基本不吸收綠光，因而綠光被反射而是葉子（大部分）顯綠色。也就是說(shuō)主要吸收這些波長(zhǎng)的光的能量在葉綠體

12、內(nèi)合成植物所需要的物質(zhì)。3、試論述高等植物光合色素的種類和生理功能植物含有幾種類型的葉綠素， 它們之間的差別在于烴側(cè)鏈的不同。大多數(shù)能進(jìn)行光合作用的細(xì)胞還有第二種類型的葉綠素，即葉綠素b 或葉綠素c。在高等植物的細(xì)胞中含有葉綠素b,而在其它一些類型的細(xì)胞中含有葉綠素 c。不同類型的葉綠素對(duì)光的吸收也是不同的，如葉綠素a 最大的吸收光的波長(zhǎng)在 420663nm,葉綠素 b 的最大吸收波長(zhǎng)范圍在460645nm。當(dāng)葉綠素分子位于葉綠體膜上時(shí)，由于葉綠素與膜蛋白的相互作用，會(huì)使光吸收的特性稍有改變。4、一般正常的植物葉片， Chla / Chlb = 3 / 1，你所測(cè)定的結(jié)果符合此比例嗎？Chl

13、a=484mg.g-1 FWChlb=158mg.g-1 FW符合5、兩種測(cè)定方法含量有何不同？為什么？快速測(cè)定法用便攜式葉綠素測(cè)定儀測(cè)定植物葉片的葉綠素含量，局部含量測(cè)定。比較準(zhǔn)確，但不便于整體測(cè)定，取樣多次平均值也不能代表整體葉綠素含量；分光光度計(jì)法采用低雜散光,高分辨率的單光束單色器,保證了波長(zhǎng)準(zhǔn)確度 .波長(zhǎng)重復(fù)性和更高的分辨率,自動(dòng)調(diào) 0%T 和 100%T,自動(dòng)調(diào)波長(zhǎng)用多種方法的數(shù)據(jù)處理功能,高分辨 ,寬大的樣品糟 ,可容納100mm,光徑吸收池和相應(yīng)的反射附件,儀器配有標(biāo)準(zhǔn)的RS-232 雙向通訊接口 ,可外接打印機(jī) ,打印相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) . 個(gè)性代的外形設(shè)計(jì) ,輕觸式按鍵使操作更為方便. 可見(jiàn)分光光度計(jì)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥 ,衛(wèi)生,化工 ,學(xué)校 ,生物化學(xué) ,石油化工 ,質(zhì)量控制 ,環(huán)境保護(hù)及科研實(shí)驗(yàn)室等化學(xué)分析 .6、怎樣把