第四章TLRs和免疫識(shí)別模式

1、第四章第四章 TLRs和免疫識(shí)別模式和免疫識(shí)別模式 一、病原體的特異性成分通過(guò)一、病原體的特異性成分通過(guò)Toll樣受體識(shí)別引發(fā)炎癥反應(yīng)樣受體識(shí)別引發(fā)炎癥反應(yīng) 病原體透過(guò)上皮細(xì)胞屏障進(jìn)入組織區(qū)域?qū)⒓せ?種類型的免疫細(xì)胞：組織中的巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和不成熟的樹(shù)突細(xì)胞。這些敏感的細(xì)胞可以區(qū)別正常組織形成的細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞受到感染所表達(dá)的組分。而識(shí)別這些不同組分的物質(zhì)正是近年來(lái)研究非常熱門的Toll樣受體識(shí)別模式。 Toll樣受體（Toll-like receptors）首先是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，它在幼年果蠅發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，并且在成年果蠅的先天免疫信號(hào)識(shí)別中起重要作用。TLRs的特征性氨基末端的胞外

2、區(qū)域含有高度重復(fù)的亮氨酸基序，也就是所謂富含亮氨酸重復(fù)序列（LRRs）、跨膜信號(hào)區(qū)域、球蛋白細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，亦即：Toll/內(nèi)亮氨酸受體（TIR）區(qū)域，TIR區(qū)域可以在IL-1受體中發(fā)現(xiàn)，也能在TLR信號(hào)途徑的接頭分子中發(fā)現(xiàn)。目前，在哺乳動(dòng)物中已確定了13個(gè)TLRs受體。TLRs可識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁或是病原體特異性核酸。這些受體識(shí)別分子是細(xì)菌或病毒入侵和復(fù)制所必需的，所以病原體不容易逃脫。例如，脂多糖（LPS）是TLR4主要的配體，是革蘭氏陰性菌的主要成分。結(jié)合LPS所需酶的缺陷型突變對(duì)大多革蘭氏陰性菌是致死的。同樣，雙鏈RNA是TLR3的配體，是所有RNA病毒復(fù)制的主要中間介導(dǎo)物，因此，這些病毒被T

3、LR識(shí)別，也很難逃脫滅亡的命運(yùn)。 第一節(jié)第一節(jié) 先天免疫的先天免疫的Toll樣受體家族（樣受體家族（TLRs） 二、有些配基需要輔助分子幫助二、有些配基需要輔助分子幫助TLRs識(shí)別識(shí)別 TLR配基的顯著特點(diǎn)是它們分子的多樣性：包括核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖。一個(gè)受體家族是如何識(shí)別所有不同種類的分子還不十分清楚。一些哺乳動(dòng)物的TLRs被認(rèn)為是直接結(jié)合到它們的先天免疫細(xì)胞的配體上，但是，在另一些情況下，有輔助蛋白幫助，使得TLRs的識(shí)別更容易：一個(gè)典型的例子就是LPS通過(guò)TLR4的識(shí)別，在這一過(guò)程中有兩個(gè)輔助蛋白和一個(gè)可溶性的脂轉(zhuǎn)移蛋白的作用。 TLR4在細(xì)胞上的應(yīng)答能力只有在第二種肽的存在下才可以

4、實(shí)現(xiàn)，這種肽叫做MD-2，它結(jié)合在TLR4的胞外區(qū)域，并且能使TLR4結(jié)合到隱藏在脂多糖內(nèi)部的脂質(zhì)體（外部的多糖區(qū)域在不同的細(xì)菌中是不一樣的）。 來(lái)自大多數(shù)細(xì)菌的LPS的應(yīng)答體可通過(guò)CD14細(xì)胞充分增強(qiáng)，CD14是一種單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞，這些細(xì)胞都是通過(guò)血清中一個(gè)叫LPS結(jié)合蛋白(LBP)的脂轉(zhuǎn)移蛋白來(lái)結(jié)合LPS。像大多數(shù)脂質(zhì)，從細(xì)胞釋放出的LPS的數(shù)量很少。LPS被先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞有效識(shí)別，這一過(guò)程需要一個(gè)機(jī)制就是提取LPS單體并呈遞給免疫細(xì)胞。這就是LBP的功能，它可以在其它脂質(zhì)體存在于LPS的脂結(jié)合位點(diǎn)時(shí)提取單體LPS，然后把LPS單體運(yùn)載并轉(zhuǎn)移到CD14分子上，這些分子

5、和CD14以及TLR4-MD-形成復(fù)合物。CD14的基因敲除或是用單克隆抗體封閉該蛋白都會(huì)減少巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞對(duì)LPS的靈敏度，但是盡管如此，一些來(lái)自細(xì)菌的LPS仍會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答。CD14也會(huì)促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞壁其它成分的應(yīng)答，包括革蘭氏陽(yáng)性菌的脂磷壁質(zhì)酸，結(jié)核分支桿菌的脂阿拉伯甘露糖。在其它的一些例子中，噬菌細(xì)胞對(duì)TLR信號(hào)的識(shí)別起作用。例如，TLR4和TLR6的二聚體對(duì)包含脂質(zhì)的配體產(chǎn)生應(yīng)答，如脂蛋白和脂磷壁質(zhì)酸，它們?cè)诰哂斜砻婊钚宰饔玫氖荏wCD36的幫助下被細(xì)胞識(shí)別，然而，這些TLRs識(shí)別的真菌細(xì)胞壁的多糖時(shí)，在跨膜的-端的樹(shù)突細(xì)胞相關(guān)性C型植物血凝素-1的幫助下會(huì)變得很容易。 三、哺

6、乳動(dòng)物的三、哺乳動(dòng)物的TLRs識(shí)別在細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的配體識(shí)別在細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的配體 盡管，識(shí)別細(xì)菌和真菌的細(xì)胞壁成分的TLRs定位在細(xì)胞表面，而識(shí)別細(xì)菌和病毒核酸的TLRs定位在細(xì)胞內(nèi)的膜上，這一過(guò)程是通過(guò)吞噬小體和內(nèi)涵體來(lái)識(shí)別它們的配體。在噬菌作用和吸收物的部分降解后釋放核酸，這些定位點(diǎn)的受體，可以區(qū)分宿主調(diào)亡細(xì)胞、微生物、病毒釋放的核酸。細(xì)胞表面的TLRs也定位于噬菌小體內(nèi)，并在和配體結(jié)合后，并在那里發(fā)送信號(hào)。 TLRs參與病毒的先天免疫過(guò)程，這些TLRs識(shí)別多種病毒產(chǎn)生的核酸配體，盡管，這些受體是如何區(qū)分病毒核酸和（胞內(nèi)）細(xì)胞核酸的機(jī)制還不清楚。TLR3的基本分子識(shí)別機(jī)制已經(jīng)基本上搞

7、清楚。TLRs識(shí)別雙鏈RNA，這個(gè)雙鏈RNA是具有RNA基因組的病毒復(fù)制所必需的介導(dǎo)體，但是，脊椎動(dòng)物也表達(dá)很少的雙鏈RNA。TLR7和TLR8識(shí)別富含鳥(niǎo)苷的單鏈RNA，現(xiàn)在仍然不清楚TLRs是如何區(qū)別病毒RNA和細(xì)胞RNA的。TLR9識(shí)別DNA的基序，這個(gè)基序包含C未甲基化的CG二核苷酸（CpG-containing DNA）。大多數(shù)這些二核苷酸在脊椎動(dòng)物的染色體中是甲基化的，在這些染色體組中，CpG的甲基化是一種基因沉默機(jī)制。 四、四、Toll樣受體及其配體樣受體及其配體 Toll樣受體是一種I-型轉(zhuǎn)膜蛋白，在昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物之間十分相似，是非常保守的。在果蠅中，Toll首先被作為胚胎的背腹

8、模式(dorsal-ventral patterning)發(fā)育的特殊分子鑒定出來(lái)的，之后又發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物抗真菌免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。在脊椎動(dòng)物中，都存在著和Toll受體同源的家族，所以命名為Toll樣家族(toll-like receptors，TLRs)。到目前為止，已經(jīng)有13個(gè)成員(TLR1-13)報(bào)道，它們分別識(shí)別不同的病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。其識(shí)別的主要分子模式如圖4.1和表4.1所示(Tabeta et al., 2004)。TLRs的一個(gè)亞家族由TLR1、2、4、5、6和11組成，表達(dá)在細(xì)胞膜上，可

9、以識(shí)別不同的結(jié)構(gòu)，并可以促進(jìn)細(xì)胞吞噬。相對(duì)來(lái)說(shuō)，其它的亞家族，也就是TLR3、7、8和9則位于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)體或溶酶體上，這些分子在那里識(shí)別核酸。 圖4.1 (A) IL-1R/TLR的超家族成員(包括：哺乳動(dòng)物、果蠅、植物和青蛙，分別以藍(lán)、紅、綠和紫色表示)。所有這些成員都含有保守的胞漿結(jié)構(gòu)域，亦即TIR結(jié)構(gòu)域。亞組-1的成員：也就是Ig亞組，都含有細(xì)胞外的Ig結(jié)構(gòu)域，并包括受體及其結(jié)合IL-1,IL-8的附件蛋白，還有單獨(dú)和T1/ST2結(jié)合的受體。亞組-2，也就是LRR亞組，包括LPS (TLR- 4)的信號(hào)傳遞受體和革蘭氏陽(yáng)性菌的分子受體，如肽聚糖和脂蛋白受體(TLR-2)。一些植物

10、的成員也屬于該亞組(用綠色表示)。接頭分子亞組包括：MyD88、Mal和TRIF，該亞組專門是作胞漿中的接頭分子。MyD88是IL-1、RI、IL-18R、TLR-2和TLR-4信號(hào)傳遞接頭分子，而Mal 則是TLR-2和TLR-4信號(hào)傳遞的接頭分子。 (B)TIR結(jié)構(gòu)域中的三個(gè)非常保守的區(qū)域(框1、框2和框3)，該圖列出的是來(lái)自31個(gè)家族的數(shù)據(jù)。其整個(gè)結(jié)構(gòu)域大約200個(gè)氨基酸殘基，氨基酸數(shù)目在保守框之間可能是變化的，依賴于特殊的受體。在該結(jié)構(gòu)域中還有附加的區(qū)域也表現(xiàn)出高度的相似性。圖4.2 TLR-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。TLR2分別和TLR1配合負(fù)責(zé)識(shí)別三酰基脂肽，而和TLR6配合則識(shí)別二酰基脂肽

11、；TLR3識(shí)別dsRNA；TLR4識(shí)別細(xì)菌LPS；TLR7/8介導(dǎo)咪喹莫特(imidazoquinolines)和ssRNA；TLR9 識(shí)別細(xì)菌和病毒的CpG DNA；TLR5識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白，鼠科動(dòng)物的TLR11負(fù)責(zé)識(shí)別尿道滋生的細(xì)菌和原生動(dòng)物-弓形體膠原蛋白樣(profilin-like molecule)分子。TLR1/2和TLR2/6利用MyD88和TIRAP/MAL作為特殊的接頭分子。TLR3則利用Trif 作為接頭分子。 TLR4利用4個(gè)接頭分子，包括：MyD88、TIRAP/MAL、Trif 和TRAM。TLR7/8、TLR9、TLR5和TLR11則只用MyD88。MyD88-

12、依賴型途徑控制炎癥應(yīng)答，而Trif 則主要介導(dǎo)I-型IFN 的應(yīng)答。另外，在pDCs 細(xì)胞中，TLR7/8和TLR9誘導(dǎo)I-型IFN是以MyD88-依賴性的。表4.1.TLRs和病原體來(lái)源的配體 受體受體配體配體TLR1/TLR2 細(xì)菌脂蛋白細(xì)菌脂蛋白 TLR2 脂蛋白脂蛋白/脂肽、脂磷壁酸、甘油肌醇脂肽、脂磷壁酸、甘油肌醇-磷脂、紅血球凝聚素、病毒的結(jié)構(gòu)蛋白磷脂、紅血球凝聚素、病毒的結(jié)構(gòu)蛋白等；內(nèi)源性配體：等；內(nèi)源性配體：Gp96、Hsp60、 Hsp70、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸、HMGB1等等TLR3 雙鏈雙鏈RNA TLR4 脂多糖、脂多糖、RSV融合蛋白、融合蛋白、MMTV被膜蛋白等；內(nèi)源

13、性配體：被膜蛋白等；內(nèi)源性配體：Gp96、Hsp60、Hsp70、透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、A, HMGB1、-防御素、表面活性蛋白等防御素、表面活性蛋白等TLR5 鞭毛蛋白鞭毛蛋白 TLR6/TLR2 二?；亩；腡LR7 咪唑喹啉、洛索立賓咪唑喹啉、洛索立賓 TLR8 咪唑喹啉、咪唑喹啉、ss RNA TLR9 含含CpG的的DNA TLR10 ? TLR11 G肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Profilin)TLR12, 13 ? (1). TLR4 內(nèi)毒素-脂多糖(lipopolysaccharide

14、，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜上的一種組分，在細(xì)胞壁的組分中是最重要的一種病原體識(shí)別模式(PAMP)。LPS的脂肪部分稱為脂肪A，負(fù)責(zé)先天免疫刺激活性。TLR4也是LPS誘導(dǎo)信號(hào)傳遞的關(guān)鍵分子，應(yīng)用一系列的輔因子進(jìn)行有效的識(shí)別。LPS首先和LPS結(jié)合蛋白(LPS binding protein，LBP)結(jié)合，然后再與CD14作用，形成糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白。該復(fù)合物結(jié)合到MD2上與TLR4聯(lián)合，導(dǎo)致其聚合，接下來(lái)就傳遞信號(hào)。一些病毒外殼蛋白，如呼吸道合胞體病毒(respiratory syncytial virus，RSV)

15、的溶解蛋白F以及小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)的外膜蛋白都可以激活TLR4并誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生。另外，MMTV還可以通過(guò)TLR4活化B細(xì)胞，誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞成熟，從而上調(diào)MMTV入侵受體(CD71)的表達(dá)，并因此加劇感染，削弱抗病毒應(yīng)答。 五、五、TLRs的功能的功能(2). TLR2、TLR1和和TLR6 除LPS之外，其它革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分也可以刺激先天免疫細(xì)胞。例如，脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)，是兩性帶負(fù)電荷的糖脂類和脂蛋白類物質(zhì)，也是重要的免疫刺激因子，并激活TLR2。TLR2與TLR

16、1 和TLR6聯(lián)合，這種相互作用可以使其識(shí)別脂蛋白的脂肪部分的不同之處。從而，TLR2/TLR1異型二聚體可以識(shí)別三?；模蒚LR2和TLR6組成的復(fù)合物則只能激活二乙酰脂肽。而且，來(lái)自某些細(xì)菌菌株的LPS，如嗜肺性菌團(tuán)菌、鉤端螺旋體和牙齦卟啉單胞菌已經(jīng)證明是TLR2的配體，而對(duì)TLR4則不起作用。然而我們也必須注意到，這些結(jié)果是和LPS聯(lián)合作用，并不依賴于TLR2的激活。對(duì)肽聚糖(peptidoglycan，PG)的識(shí)別，作為一個(gè)大分子，其組成-N乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine，GlcNac)和N乙酰胞壁酸(N-acetyl muramic acid，MurNa

17、c)糖側(cè)鏈經(jīng)過(guò)一個(gè)肽橋的互連也對(duì)TLR2的激活具有重要貢獻(xiàn)，當(dāng)然這一結(jié)果尚有爭(zhēng)議。在對(duì)TLR2和PG之間的識(shí)別機(jī)制作推測(cè)的時(shí)候需要慎重，因?yàn)閺纳锘瘜W(xué)的角度來(lái)看，分離純化的PG往往是一個(gè)混合物，例如其中混雜的脂蛋白或LTA都可能激活TLR2。而且，TLR2也可以被病毒蛋白活化，如麻疹病毒的紅血球凝集素，細(xì)胞巨化病毒和單純皰疹病毒的結(jié)構(gòu)蛋白等。另外，原生動(dòng)物，如原蟲(chóng)枯氏錐蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)、碩大利什曼原蟲(chóng)和惡性瘧原蟲(chóng)也含有TLR2的配體，如GPI錨定物。 (3). TLR5 很多病原體都能運(yùn)動(dòng)，用鞭毛作為其運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力。鞭毛的主要組成是鞭毛蛋白，它是一種TLR5重要的激活因子。TLR5識(shí)別鞭毛蛋白的D

18、1結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在多個(gè)不同的種中都是共同的。上皮細(xì)胞的TLR5是在基底面一側(cè)(basolateral side,BL)表達(dá)的，因此鞭毛蛋白只有當(dāng)生有鞭毛的病原體跨過(guò)上皮入侵時(shí)才能識(shí)別。最近的報(bào)道證明有沙門氏菌所產(chǎn)生的單體鞭毛蛋白在感染小腸上皮細(xì)胞時(shí)，不僅產(chǎn)生了鞭毛相關(guān)的多聚體成分，而且直接激活宿主細(xì)胞，合成和分泌了溶血磷脂(lysophospholipids)。 (4). TLR11 尿道致病細(xì)菌由小鼠的TLR11進(jìn)行識(shí)別(而人類則無(wú)此功能)，雖然識(shí)別TLR11的配體迄今尚未鑒定出來(lái)。而且，已知?jiǎng)偟毓蜗x(chóng)含有一個(gè)膠原樣分子(profilin-like molecule)，以一種至今尚不清楚的

19、機(jī)制激活小鼠的TLR11，并誘導(dǎo)誘發(fā)炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。 (5). TLR3 TLR3識(shí)別dsRNA以及人工合成的多聚肌苷胞苷酸(polyinosine-polycytidilic acid，polyI:C) ，并可以誘導(dǎo)I-型IFN。dsRNA是ssRNA或DNA病毒繁殖的中間產(chǎn)物，因此，dsRNA也是非常廣泛的病毒的代表性識(shí)別模式(PAMP)?？茖W(xué)家堅(jiān)信TLR3是這一成分的重要受體，在抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。然而用不同的病毒如：鼠科動(dòng)物細(xì)胞巨化病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)、皰疹性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV

20、)、淋巴脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphochoriomeningitis virus，LCMV)和呼腸孤病毒(reovirus)對(duì)野生型和TLR3-/-小鼠進(jìn)行感染試驗(yàn)，結(jié)果證明TLR3并不是抗病毒免疫應(yīng)答所必需的。相反，西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV) 作為黃熱病毒屬(flavivirus)的一種ssRNA病毒入侵人的機(jī)體后可以產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞損傷，它倒是可以用TLR3介導(dǎo)發(fā)炎型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNF-。由于TNF-會(huì)導(dǎo)致血腦屏障破壞，所以病毒誘導(dǎo)的TLR3激活實(shí)際上促進(jìn)了病毒進(jìn)入大腦。因此，TLR3-/-小鼠當(dāng)遇到WNV感染時(shí)和野生型一樣都對(duì)感染是敏感的。 (6). TL

21、R7/8 單鏈(ss)鳥(niǎo)苷和/或富含尿嘧啶的RNA和ssRNA病毒，如：流感病毒(VSV)，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)可以被TLR7和/或TLR8所識(shí)別。這兩個(gè)基因互相之間有同源性，位于X染色體上。這兩個(gè)受體也識(shí)別人工合成的抗病毒核酸類似物，如喹啉衍生物(imidazoquinolines)或洛索洛芬(loxoribine)。TLR7介導(dǎo)流感病毒NDV和VSV的識(shí)別，特別是在樹(shù)突細(xì)胞中，也就是所謂骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞plasmacytoid dendritic cell，pDC)或天然干擾素-生成細(xì)胞(natural interferon- produc

22、ing cells，NIPCs)。該細(xì)胞類型的特點(diǎn)就是具有很高的分泌大量干擾素-來(lái)抗病毒感染的能力。其它細(xì)胞類型，如常規(guī)的樹(shù)突細(xì)胞和纖維原細(xì)胞在遇到單鏈RNA病毒入侵時(shí)，也可以以不依賴于TLR7的形式產(chǎn)生I-型干擾素。這些觀察表明，在傳感病毒感染時(shí)還有另外的途徑。這些TLR非依賴性受體存在于非pDC細(xì)胞中，就是RNA解旋酶(the RNA helicase)，命名為RIG-I和MDA-5，推測(cè)是由它們識(shí)別病毒RNA，然后產(chǎn)生I型IFN。 (7). TLR9TLR9識(shí)別細(xì)菌基因組DNA。Tokunaga et al. (1984)率先證明細(xì)菌DNA自身含有卡介苗成分，可以促進(jìn)免疫刺激和抗腫瘤作用

23、。細(xì)菌DNA的這種刺激作用是由于它們存在一種未甲基化的CpG二核苷酸，這種特殊的堿基組成也就是所謂的CpG基序。脊椎動(dòng)物的DNA中的CpG二核苷酸是甲基化了的，或者產(chǎn)生的機(jī)率很低(CpG抑制)，甚至可能存在專門的抑制序列，所以不會(huì)被刺激。細(xì)菌DNA的這種免疫刺激作用可以用人工合成的含有CpG-基序(CpG-ODN)的寡核苷酸進(jìn)行模擬。DNA病毒，如MCMV，單純皰疹病毒1和2 (HSV-1/HSV-2)也可以被TLR9識(shí)別，并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子和I型IFN的產(chǎn)生和分泌。TLR9介導(dǎo)的IFN-對(duì)HSV-1和HSV-2的應(yīng)答就是限于pDC。細(xì)胞激活并不需要病毒的感染，因?yàn)榛畹?、加熱和紫外光滅活的HS

24、V-1/ HSV-2都可以刺激高水平的IFN-表達(dá)。相反，巨噬細(xì)胞對(duì)于HSV感染所產(chǎn)生的IFN-則是以TLR9非依賴性的方式產(chǎn)生的，這說(shuō)明pDC和TLR9非依賴性另外的機(jī)制也是存在的，也可以對(duì)DNA病毒入侵產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。 (8). TLRs對(duì)內(nèi)源性配體的識(shí)別對(duì)內(nèi)源性配體的識(shí)別 TLRs對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物結(jié)構(gòu)的識(shí)別是可以區(qū)分自身和外來(lái)異物的重要基礎(chǔ)。然而，內(nèi)生型TLR配體也有報(bào)道可以被識(shí)別。而且，非常多的研究證明熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)，例如：Hsp60、Hsp70和gp96都是免疫系統(tǒng)的重要激活劑。細(xì)菌和哺乳動(dòng)物來(lái)源的Hsp都可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生

25、發(fā)炎性細(xì)胞因子，如TNF-、IL-1和IL-6，并可以上調(diào)表達(dá)APC的輔助刺激分子。相似的產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用也有哺乳動(dòng)物來(lái)源的各種分子，如纖維蛋白原、膜表面活性蛋白A、纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)、乙酰肝素硫酸、透明質(zhì)酸的低聚糖、-防御素71和高遷移率蛋白組-1(high-mobility group protein 1，HMGB1)。所有上述物質(zhì)都可以分別作為TLR4和/或TLR2的配體。由于內(nèi)源性配體對(duì)于細(xì)胞因子類型的作用相似于LPS和脂蛋白，所以TLR2和TLR4在識(shí)別內(nèi)源結(jié)構(gòu)的作用也得到了研究人員的密切關(guān)注。LPS或脂蛋白從生物化學(xué)的角度來(lái)看也可能混進(jìn)內(nèi)源性配體，從而對(duì)

26、觀察有影響。 內(nèi)源性的核酸，例如RNA和DNA都可能在某些條件下激活TLRs，從而或者促進(jìn)或者維持自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)等。由于對(duì)自身核抗原的免疫耐受性的丟失，所以抗自身DNA、RNA、組蛋白和RNA結(jié)合蛋白，如Sm/RNP的抗體就會(huì)產(chǎn)生，和DNA或RNA形成免疫復(fù)合物(ICs)。這些ICs積聚在腎臟病導(dǎo)致腎小球性腎炎(glomerulonephritis)。這些識(shí)別核酸的抗體和/或相關(guān)的蛋白由自身反應(yīng)性B細(xì)胞合成。在該系統(tǒng)中，BCR首先識(shí)別自身抗體的Fc-區(qū)，并引發(fā)ICs的內(nèi)吞作用，進(jìn)入內(nèi)體，而TLR9就定居在這里

27、。相同的例子是已經(jīng)被報(bào)道的含RNA抗體和TLR7激活的病例。pDC的激活和IFN-的分泌是由RNA或DNA/IC通過(guò)FcgRIII (小鼠)或者通過(guò)FcgRIIa(人類)的內(nèi)吞作用而形成的。這些核酸吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)體，在那里以TLR7依賴性方式以及TLR9依賴性模式誘導(dǎo)IFN-的生成。 六、六、 TLR信號(hào)傳遞及其所涉及的信號(hào)傳遞及其所涉及的Th1/Th2免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答 TLRs通過(guò)與其對(duì)應(yīng)的配體識(shí)別和相互作用導(dǎo)致一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大過(guò)程，從而引發(fā)涉及機(jī)體對(duì)病原體作出免疫應(yīng)答的基因的表達(dá)。一般來(lái)講，有三條主要激活途徑：第一，激活的重點(diǎn)是和轉(zhuǎn)錄因子NF-B，它構(gòu)成發(fā)炎作用的總開(kāi)關(guān)。第二，導(dǎo)致MA

28、P激酶(MAP kinases)p38和Jun 氨基末端激酶(Jun aminoterminal kinase，JNK)的激活，它也參與了轉(zhuǎn)錄作用的增加。第三條途徑就是導(dǎo)致I-型IFN通過(guò)IFN調(diào)節(jié)因子(IFN regulatory factors，IRFs)的激活。 圖4.3 TLRs和各種信號(hào)途徑。TLRs的激活誘導(dǎo)發(fā)炎性細(xì)胞因子、I型IFN和抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生，這個(gè)過(guò)程依賴于特異性TLR、細(xì)胞類型和傳遞信號(hào)所用的接頭分子(MyD88、TIRAP、TRAM和TRIF)。發(fā)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)是通過(guò)IRAK1、IRAK4、TRAF6和轉(zhuǎn)錄因子NF-B的激活而啟動(dòng)的。NF-B的激活也可

29、以通過(guò)TLR3與TRIF和RIP-1途徑誘導(dǎo)。IL-10和I型IFN的產(chǎn)生是由TRAF3控制的，I型IFN的產(chǎn)生也依賴于轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和IRF-7。 TLRs-介導(dǎo)的免疫細(xì)胞激活將導(dǎo)致IFN-、發(fā)炎性細(xì)胞因子，如：TNF-、IL-1和IL-6的表達(dá)，同時(shí)也控制著細(xì)胞因子IL-12和IL-18從而促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化。因此在MyD88缺陷型小鼠中，就缺少TLR介導(dǎo)的信號(hào)傳遞作用，結(jié)果導(dǎo)致Th2型細(xì)胞應(yīng)答的大大加強(qiáng)，并產(chǎn)生大量的IgE(Schnare et al., 2001)。TLR信號(hào)傳遞在Th1免疫應(yīng)答中的重要性意味著TLR表達(dá)的改變可能會(huì)影響發(fā)育和嚴(yán)重的超敏性疾病。此外，TLRs過(guò)強(qiáng)的

30、Th1誘導(dǎo)活性也會(huì)帶來(lái)TLR配體過(guò)量集中在處理Th2免疫應(yīng)答，從而加劇超敏性疾病的病情。對(duì)于有些TLRs，例如，TLR2和TLR5對(duì)于誘導(dǎo)Th1或Th2應(yīng)答，都有相互矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道，這些報(bào)告表明了Th1或者Th2的分化依賴于所處理的配體的純度。而且，LPS的濃度也決定了什么類型免疫應(yīng)答被啟動(dòng)。低濃度可以誘導(dǎo)MyD88依賴性Th2激活，而高濃度的LPS則誘導(dǎo)MyD88依賴性Th1應(yīng)答。對(duì)于通過(guò)Trif 和 TLR3所誘導(dǎo)的MyD88-非依賴性激活作用，則對(duì)Th1免疫應(yīng)答具有強(qiáng)誘導(dǎo)作用。 第二節(jié)第二節(jié) TLR信號(hào)傳遞系統(tǒng)信號(hào)傳遞系統(tǒng) 脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)分為兩類：先天免疫和獲得性免疫。存在于脊椎

31、動(dòng)物體內(nèi)的獲得性免疫依賴于表達(dá)在克隆增殖的T及B 淋巴細(xì)胞表面的特異性抗原受體，這些特異性抗原受體由基因重排和高突變位點(diǎn)產(chǎn)生。先天免疫系統(tǒng)是進(jìn)化過(guò)程中保留下來(lái)的，是保護(hù)宿主免受病原體侵害的第一道防御機(jī)制。一直以來(lái)，先天免疫被認(rèn)為是由吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的非特異性免疫反應(yīng)，如巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，可以吞噬并降解入侵的病原體。然而，有研究表明帶有發(fā)生了Toll 受體功能丟失突變的果蠅對(duì)真菌感染表現(xiàn)出高敏感性，且不能誘導(dǎo)形成抗菌肽，這為果蠅是通過(guò)表達(dá)特異性受體來(lái)識(shí)別真菌感染的理論首次提供了證據(jù)。隨后，又有人發(fā)現(xiàn)了人hToll同族體，這種蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，表達(dá)協(xié)同刺激分子。更引人注目的是在低響應(yīng)

32、的脂多糖型鼠中發(fā)現(xiàn)了鼠hToll功能缺失同族體。這些前沿的研究為我們集中研究識(shí)別病原菌和激活先天免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制開(kāi)辟了新的方向。 一、由一、由MyD88依賴途徑激活依賴途徑激活 NF-B 和和AP-1 TLRs 包括能識(shí)別病原菌的富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外域和引起胞內(nèi)信號(hào)所必需的跨膜區(qū) Toll/白介素-1受體結(jié)構(gòu)域。所有的TLRs 引起本身所固有的炎癥途徑，最終激活NF-B和AP-1。NF-B 是二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，屬于包含與Rel同源的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族，它包括 p65/RelA 、p50/NF-B1 、p52/NF-B2、RelB和c-Rel，在大多數(shù)細(xì)胞中存在的典型的NF-B 是由p

33、65和p50亞基組成的異源二聚體。在未被刺激的細(xì)胞中，NF-B以與NF-B抑制劑（IB）結(jié)合的非活性形式隱匿于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)被各種TLR配體刺激時(shí)，IBs 的絲氨酸殘基被由IKK、IKK蛋白質(zhì)激酶，IKK/Nemo 調(diào)節(jié)分子組成的IKK復(fù)合體磷酸化。26S 蛋白酶體對(duì)IBs的普遍的降解的磷酸化作用，使NF-B 釋放到細(xì)胞核中，并與B 位點(diǎn)結(jié)合。AP-1 是亮氨酸拉鏈二聚體蛋白，與TPA響應(yīng)元件和cAMP響應(yīng)元件結(jié)合，它的成員有Jun、Fos、或激活轉(zhuǎn)錄因子和Maf 亞科。在AP-1蛋白家族中，c-Jun 被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中起主要作用。TLR 激活A(yù)P-1的信號(hào)大多由MAP激酶 （如c-Jun N

34、末端激酶JUK，p38 和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK）所介導(dǎo)，這些MAP激酶由許多TLR配體以同樣的動(dòng)力激活。 2、由、由Trif依賴性途徑激活依賴性途徑激活NF-B、AP-1 從MyD88缺乏的鼠中分離到的巨噬細(xì)胞和DCs不能激活NF-B 和MAP激酶，不能識(shí)別TLR2、TLR5、TLR7和TLR9這些TLR配體而誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子，這說(shuō)明MyD88是這些TLRs的唯一的連接分子。MyD88缺乏的細(xì)胞在識(shí)別LPS時(shí)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子，而在MyD88缺乏的鼠細(xì)胞中，LPS還是可以激活NF-B 和MAP激酶，可是在MyD88缺乏細(xì)胞中的這種激活作用達(dá)到最高要比在野生型細(xì)胞中延遲；在不依賴MyD88

35、的巨噬細(xì)胞和DCs 中，LPS可誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN。在對(duì)病毒感染和LPS反應(yīng)而產(chǎn)生的IFN-1，是誘導(dǎo)靶細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)和促進(jìn)抗病毒的獲得性免疫過(guò)程中的關(guān)鍵因子?？傊@些報(bào)道說(shuō)明TLR4信號(hào)途徑中由其它連接分子介導(dǎo)的NF-B 和MAP激酶的延遲激活都與IFN-1有關(guān)。這些文章指出，不依賴MyD88的途徑需要 Trif 參與，Trif有激活NF-B 、MAP激酶和IFN啟動(dòng)子的重要作用，而MyD88和TIRAP/MyD88-adapter-like（MAL）就沒(méi)有激活I(lǐng)FN促進(jìn)劑的能力。Trif缺乏鼠不能對(duì)LPS 反應(yīng)產(chǎn)生IFN-1；而識(shí)別LPS，對(duì)NF-B 、MAP激酶的早期激活作用仍然正常；

36、這表明Trif在TLR4信號(hào)途徑中IFN-1的誘導(dǎo)起著關(guān)鍵作用（圖4.2、3）。此外，Trif缺乏的鼠中，炎癥因子的表達(dá)量減少。這說(shuō)明在MyD88、Trif依賴途徑中都需要，最大量的表達(dá)炎癥因子來(lái)響應(yīng)LPS，而Trif依賴途徑是如何促進(jìn)炎癥反應(yīng)的，現(xiàn)在還不清楚。 圖4.4 TLR3和TLR4介導(dǎo)的信號(hào)途徑。TLR4的激活是依賴于MyD88和Trif的途徑傳遞信號(hào)的。TIRAP/Mal和TRAM分別是MyD88和Trif依賴性信號(hào)途徑所必需的。MyD88在配體刺激以后招募IRAK4 和TRAF6。TRAF6通過(guò)K63-連接的泛素化作用(Ub)激活TAK1/TAB1/TAB2/ TAB3復(fù)合物。激

37、活的TAK1復(fù)合物接著在激活由IKK、IKK和IKK/Nemo所組成的IKK復(fù)合物，該復(fù)合物催化IBs (P)的脫磷酸化。IBs由蛋白酶體途徑降解，從而允許NF-B轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。TAK1同時(shí)激活MAP激酶途經(jīng)，其結(jié)果是導(dǎo)致AP-1的磷酸化并激活。NF-B和AP-1控制誘導(dǎo)發(fā)炎性細(xì)胞因子所產(chǎn)生的炎癥應(yīng)答。TLR4也招募TRAM 和Trif，它們和TBK1相互作用。TBK1和IKKi一起介導(dǎo)IRF3 (P)的磷酸化。 磷酸化了的IRF3二聚體化，并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，結(jié)合到DNA上。Trif也與TRAF6和RIP1相互作用，從而介導(dǎo)NF-kB的激活。IRF3、NF-kB和AP-1的激活也是， 誘導(dǎo)I

38、型IFN特別是IFN-b的合成所必需的，TLR3，位于內(nèi)體囊泡中，它應(yīng)用Trif，而不是MyD88、TIRAP/Mal和TRAM作為信號(hào)傳遞的接頭分子。 3、由、由TLR3和和TLR4激活激活I(lǐng)RFs 就像上面所提到的， Trif 依賴性途徑由TLR3和TLR4 激活后 ，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-1型，特別是IFN-。IFN基因的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)密控制，通過(guò)多種轉(zhuǎn)錄因子的共同激活來(lái)控制，這些轉(zhuǎn)錄因子包括NF-B、ATF2/c-Jun、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）3和IRF7。NF-B、ATF2/c-Jun在TLR配體、IL-1、TNF和DNA 損傷的刺激下被激活，IRF3和IRF7在細(xì)胞識(shí)別LPS、poly I

39、C 和遭受病毒感染時(shí)被激活，它們主要是調(diào)控IFN-1型；在未被刺激的條件下，IRF3和IRF7以結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，受到刺激后，這些蛋白質(zhì)在非典型IKKs、TANK結(jié)合激酶1（TBK1）（也稱T2K、NAK）和IKKi（也稱IKK）的作用下，被磷酸化，然后轉(zhuǎn)移到核區(qū)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。在TBK1缺乏的細(xì)胞中，IRF3僅有殘余的活化作用，當(dāng)TBK1和IKKi 同時(shí)缺乏時(shí)，IRF3的活化作用完全喪失，這說(shuō)明纖維原細(xì)胞中，TBK1和IKKi的功能是多余的。IRF7在未受到刺激的細(xì)胞中表達(dá)微弱，當(dāng)受到LPS、IFN-1型或病毒感染刺激時(shí)，急劇誘導(dǎo)其表達(dá)，而IRF3則是構(gòu)成性表達(dá)。因此，引發(fā)

40、誘導(dǎo)IFN在很大程度上取決于IRF3的活性。分泌的IFN-作用于臨近細(xì)胞，通過(guò)IFN-1受體活化JAK-STAT途徑，誘導(dǎo)IRF7表達(dá)，于是對(duì)IFN-1的誘導(dǎo)作用通過(guò)正反饋機(jī)制而被放大。MyD88缺乏的細(xì)胞在響應(yīng)LPS、poly IC 刺激時(shí)，IRF3顯示正常的活性，而 Trif缺乏的細(xì)胞中的IRF3卻沒(méi)有活性。還有Trif 與TBK1結(jié)合。綜上所述，在TLR3 和TLR4 信號(hào)途徑中它們對(duì)IFN-1 的誘導(dǎo)調(diào)控作用依次為TrifTBK1/IKKiIRF3（圖4.4）。 4、由、由TLR7/8和和TLR8/9 激活激活 IRFs 正如我們所知，TLR7/8和TLR8/9 配體通過(guò)漿細(xì)胞增殖 D

41、Cs （pDC）誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-1。在響應(yīng) TLR7/8和TLR8/9 配體、病毒感染的刺激時(shí)，子代DCs 活化誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-1，這些誘導(dǎo)作用的發(fā)生不依賴于反饋信號(hào)。IRF3缺乏的pDCs 可正常的響應(yīng)TLRs，而MyD88和IRAK4同時(shí)缺陷的pDCs則不能誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-1 和炎癥細(xì)胞因子。與其它類型的DCs不同，pDCs 可高水平組成性表達(dá)IRF7。有報(bào)道稱當(dāng)用TLR9 配體處理pDCs 時(shí)，會(huì)使IRF7向細(xì)胞核移動(dòng)。由IRF7 缺乏的鼠中分離的pDCs，不能對(duì)TLR7/8 和IRF9做出響應(yīng)而誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-1；這說(shuō)明IRF7是pDCs調(diào)節(jié)IFN-1所必需的轉(zhuǎn)錄因子。更重要的是

42、，IRF7可以和MyD88、IRAK1、TRAF6形成信號(hào)復(fù)合物。值得注意的是，當(dāng)IRAK1缺陷時(shí)，pDCs 就不能對(duì)TLR7和TLR9配體響應(yīng)而誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN和激活I(lǐng)RF7。已經(jīng)有試管試驗(yàn)明確顯示了IRAK1有使IRF7磷酸化的能力，而不是IRAK4。與此相對(duì)，有報(bào)道稱，缺乏IRAK1的pDCs，在對(duì)TLR7和TLR9配體做出響應(yīng)時(shí)，NF-B的誘導(dǎo)、MAP激酶的活化、炎癥因子的產(chǎn)生仍然正常。這說(shuō)明IRAK1專一介導(dǎo)MyD88和IRAK4下游的IRF7的激活。還有報(bào)道稱，TRAF6 E3 泛素連接酶的活化需要IRF7的激活，但TRAF6依賴性泛素化的作用還不清楚（圖4.5）。 5、不依賴、不依

43、賴TLR對(duì)病毒組分的識(shí)別對(duì)病毒組分的識(shí)別 由TLR3、TLR7/8、TLR9識(shí)別病毒組分，并誘導(dǎo)IFN-1產(chǎn)生的體內(nèi)激活區(qū)域，而不在細(xì)胞表面。這表明TLRs識(shí)別的是，病毒或細(xì)菌被內(nèi)化和溶解后釋放到內(nèi)涵體的核酸。一旦病毒直接進(jìn)入胞液，開(kāi)始dsDNA 的復(fù)制，TLRS 就不能識(shí)別病毒。有報(bào)道稱，pDCs 通過(guò)不依賴MyD88的方式，識(shí)別RSV而引發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-1的作用，就是當(dāng)病毒進(jìn)入胞液并復(fù)制時(shí)誘導(dǎo)的。還有的pDCs 通過(guò)TLR9識(shí)別染色體雜交HSV-1，這是因?yàn)楫?dāng)局部感染后，缺乏TLR9的鼠中HSV-1的復(fù)制沒(méi)有增加。在缺失TLR3的情況下，對(duì)鼠細(xì)胞巨化病毒，口腔皰疹病毒，淋巴細(xì)胞的脈絡(luò)叢腦

44、膜炎病毒，和呼吸道腸道病毒的獲得性免疫反應(yīng)沒(méi)有受到影響。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行poly IC 時(shí)和受到 Sendai 病毒（SeV）、新城病毒、和VSV病毒的侵染時(shí)，由TLR3缺乏的鼠中分離到的纖維原細(xì)胞或傳統(tǒng)的DCs會(huì)產(chǎn)生IFN-。綜上所述，可知宿主細(xì)胞可表達(dá)能發(fā)現(xiàn)積極的復(fù)制病毒的細(xì)胞質(zhì)傳感器。在這個(gè)環(huán)節(jié)中，通過(guò)一種功能篩選的方法識(shí)別一種叫視黃酸可誘導(dǎo)基因-1 (RIG-I)的細(xì)胞質(zhì)蛋白。RIG-I是包含有兩個(gè)半胱天冬蛋白酶結(jié)合域樣（CARD樣）結(jié)構(gòu)域的DExD/Hbox RNA 螺旋酶(helicase)。螺旋的結(jié)構(gòu)域與dsRNA結(jié)合，CARD樣結(jié)構(gòu)域可激活誘導(dǎo)IRF3、NF-B 和MAP激酶產(chǎn)生的

45、下游信號(hào)。在抗病毒反應(yīng)中，過(guò)量表達(dá)RIG-1時(shí)，從RIG-1缺乏的鼠中分離到的傳統(tǒng)DCs和纖維原細(xì)胞，在感染了NDV、SeV和VSV后，不會(huì)產(chǎn)生IFN-1和炎癥因子。黑素瘤分化相關(guān)基因5（Mda5）（也稱Helicard）與RIG-1結(jié)構(gòu)相似，也含有兩個(gè)CARD樣和單螺旋結(jié)構(gòu)域，有研究表明其可介導(dǎo)抗病毒反應(yīng)。有研究稱LGP-2有對(duì)RIG-1和Mda5負(fù)調(diào)節(jié)的功能，因此認(rèn)為其也與RIG-1和Mda5相關(guān)，但是缺少CARD樣結(jié)構(gòu)域（圖4.6）。 圖4.5 TLR7/8和TLR9介導(dǎo)的信號(hào)途徑。TLR7/8和TLR9內(nèi)體部分表達(dá)。在和配體連接之后，這些TLRs啟動(dòng)MyD88-依賴性信號(hào)途徑來(lái)控制炎癥

46、應(yīng)答，這是通過(guò)激活NF-B和AP-1來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于pDCs(漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞), IRF7是組成型表達(dá)的，并與MyD88、IRAK1和IRAK4形成一個(gè)信號(hào)傳遞復(fù)合物。在對(duì)配體的刺激做出應(yīng)答時(shí)，IRF7被IRAK1磷酸化，形成二聚體，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中。而且，TRAF6-依賴性泛素化作用也是激活I(lǐng)RF7所必需的。IRF7和NF-B以及AP-1一起控制I型IFN、包括IFN-和IFN-的表達(dá)。 6、RIG-1和和Mda-5介導(dǎo)的信號(hào)途徑介導(dǎo)的信號(hào)途徑 從TBK1和IKKi雙缺陷的鼠中分離到的胚纖維原細(xì)胞，在受到病毒感染或給與dsRNA時(shí)，不能誘導(dǎo)IFN-的產(chǎn)生。這可能是由于RIG-1和Mda5可利用

47、一種含有與CARD類似的連接分子，將這些螺旋連接到TBK1和IKKi。最近，有研究發(fā)現(xiàn)干擾素前體刺激劑1（也稱線粒體抗病毒信號(hào)蛋白MAVS，誘導(dǎo)病毒信號(hào)連接分子或Cardif）是包含著N末端CARD結(jié)構(gòu)域的IFN-前體的潛在激活劑。IPS-1通過(guò)CARD結(jié)構(gòu)域?qū)IG-1和Mda5連接起來(lái)。相反地，以siRNA敲除了IPS-1后，對(duì)病毒反應(yīng)而誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-1的作用被削弱了，而病毒復(fù)制則加強(qiáng)了。有報(bào)道稱，病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN的誘導(dǎo)過(guò)程，包含在最初發(fā)現(xiàn)的與TNF受體家族的死亡受體相關(guān)的Fas相關(guān)聯(lián)的死亡結(jié)構(gòu)域和RIP1里。IPS-1通過(guò)與FADD和RIP-1的非CARD區(qū)結(jié)合，來(lái)促進(jìn)NF-B，

48、而不是激活I(lǐng)RF3（圖4.6）。 圖4.6 RIG-I和Mda5介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑。細(xì)胞表達(dá)胞漿RNA解旋酶(RIG-I、Mda5和LGP2) ，從而識(shí)別復(fù)制中的病毒。RIG-I和Mda5含有CARD-樣結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)是信號(hào)傳遞所必需的。解旋酶的CARDs和一個(gè)接頭分子IPS-1(也被稱為MAVS、VISA或Cardif)相互作用。IPS-1位于線粒體中，并可以抑制細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞途徑，從而導(dǎo)致IRF3、NF-B和AP-1分別應(yīng)用TBK1/IKKi、IKK/IKK和MAP激酶激活。FADD和RIP1也涉及到RIG-I和Mda5-依賴途徑。FADD和RIP1兩者都可以激活NF-B，而且IPS-1

49、也可以促進(jìn)FADD和RIP-1介導(dǎo)的NF-B激活作用。然而，IPS-1如何激活I(lǐng)RF3、NF-B和AP-1的精確機(jī)制目前尚不清楚。 第三節(jié)第三節(jié) TLRs信號(hào)途徑及其在抗感染中的作用信號(hào)途徑及其在抗感染中的作用 最近幾年，我們對(duì)先天免疫的作用的了解有了很大的進(jìn)步，尤其是TLRs信號(hào)途徑在機(jī)體抗感染中的作用。在病人體內(nèi)，人的TLRs缺失會(huì)加劇感染，如高度脫水性外胚層發(fā)育不良的免疫缺陷和IRAK4缺陷。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，使我們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到控制先天免疫反應(yīng)的遺傳變異可通過(guò)特有的方式精細(xì)地調(diào)節(jié)易感性。本節(jié)將就可遺傳變異的宿主和微生物間的綜合聯(lián)系導(dǎo)致的感染和易感性機(jī)制作較為系統(tǒng)的分析和探討，

50、并探究怎樣才能應(yīng)用這種新的認(rèn)識(shí)更好地治療病人。 圖4.7人TLRs信號(hào)途徑。TLR復(fù)合物引起信號(hào)傳遞，從而能最大程度上使轉(zhuǎn)錄因子NF-B和其它的一些因子遷移到核區(qū)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。此途徑的基因編碼中的突變和多態(tài)現(xiàn)象似乎可改變傳染的易感性。孟德?tīng)栠z傳和單基因失序：孟德?tīng)栠z傳和單基因失序：異常異常TLR信號(hào)引起的主要免疫缺陷信號(hào)引起的主要免疫缺陷 人體中自然發(fā)生的基因突變，引起極度的免疫缺陷表現(xiàn)型，對(duì)特異性免疫缺陷和人類體內(nèi)疾病形成之間的聯(lián)系具有極強(qiáng)的決定能力。近來(lái)有三個(gè)人的研究表明這條途徑對(duì)人類抵御感染起關(guān)鍵性作用（表4.3）。 表4.3 人單基因免疫缺陷對(duì)TLR功能的影響 臨床免疫缺陷突變

51、基因突變的蛋白受損的免疫途徑對(duì)感染的敏感性X-連鎖隱性 EDA-IDIKBKGIKKg (NEMO)多條先天免疫和獲得性免疫途徑化膿性細(xì)菌感染(Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae) Atypical mycobacteria (Mycobacterium avium intracellulare)自體結(jié)構(gòu)域EDA-IDNFKBIAInBa多條先天免疫和獲得性免疫途徑上述細(xì)菌IRAK4缺陷IRAK4IRAK4TLR信號(hào)傳遞化膿性細(xì)菌感染(Streptococcus pneumoniae,

52、Staphylococcus aureus)第四節(jié)第四節(jié) TLR在免疫佐劑及治療中的作用在免疫佐劑及治療中的作用 有療效的疫苗主要包括抗原和佐劑兩個(gè)組成部分，由微生物模式分子組成的佐劑在接種中起著核心作用。成功的疫苗需要有效地誘導(dǎo)抗體、IFN-I、細(xì)胞因子/趨化因子，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。髓系樹(shù)突細(xì)胞（mDC）上的TLRs是佐劑受體，并且是佐劑活性的分子基礎(chǔ)?，F(xiàn)在，大家一致認(rèn)為TLRs及其接頭分子優(yōu)先發(fā)出誘導(dǎo)IFN-/、趨化因子和發(fā)炎性細(xì)胞因子的信號(hào)，并可以誘導(dǎo)mDC成熟，從而加強(qiáng)抗原提呈。雖然大多數(shù)的數(shù)據(jù)來(lái)自于小鼠，但其結(jié)果可認(rèn)為也是適用于人類，無(wú)論TLR途徑是在mDC、NK和CTL

53、中被激活的，總之這種作用是應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的。在mDC中，為了誘導(dǎo)特異性抗原CTL趨向需要被吞噬處理過(guò)的物質(zhì)，引發(fā)了交叉激活作用。一直以來(lái)，大家都認(rèn)為不同的佐劑可引發(fā)不同的TLR 反應(yīng)，而mDC的功能卻被曲解為依賴于mDC成熟過(guò)程中的佐劑的特異趨向性。這說(shuō)明mDC 的適時(shí)和適當(dāng)成熟在很大程度上依賴于TLRs合適的位點(diǎn)選擇和TLRs連接的信號(hào)途徑。有人發(fā)現(xiàn)，TLRs和輔助刺激分子形成嵌合體分子與靶抗原相識(shí)別，可有效地誘導(dǎo)CTL消滅靶細(xì)胞。本節(jié)我們將概述人體中的TLRs及其接頭分子在各種宿主免疫反應(yīng)中的作用，并將系統(tǒng)介紹疫苗治療中操縱這些受體和接頭分子的相關(guān)佐劑的研究。 一、作為一、作為TLRs配體的各種

54、佐劑配體的各種佐劑 對(duì)宿主免疫激活有較高潛力的微生物模式分子也用作佐劑。許多有感染力的微生物和來(lái)自宿主的內(nèi)源性物質(zhì)都具有佐劑活性。由結(jié)合了礦物油的死菌組成的福氏佐劑(FCA)可加強(qiáng)疫苗反應(yīng)，例如可刺激產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)CTL和激活NK。如果沒(méi)有佐劑的參與，接種疫苗過(guò)程中一般僅能觀察到非常弱的疫苗反應(yīng)。所以，佐劑是引起強(qiáng)的宿主免疫反應(yīng)得必需因子。還有報(bào)道已闡明，抗原提呈類細(xì)胞中的代表性細(xì)胞群-髓系樹(shù)突細(xì)胞（mDC），以前被稱為可產(chǎn)生干擾素-1的細(xì)胞漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞（pDCs），都是大多數(shù)佐劑的靶標(biāo)。Janeway 和Medzhitov的報(bào)道稱DCs可表達(dá)兩種類型的受體，一種是可接受由MHC提呈抗原受

55、體，另一類是微生物模式分子受體即佐劑受體。這些從微生物中分離到的抗原和佐劑模式分子可以以不同方式作用于mDCs，從而有效地誘導(dǎo)生成許多可繼發(fā)性激活淋巴細(xì)胞的激動(dòng)劑。 二、二、TLRs 在在DCs 中的作用中的作用 mDCs對(duì)于T/B細(xì)胞的激活是至關(guān)重要的。mDCs通過(guò)誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化，來(lái)促進(jìn)抗體產(chǎn)生。成熟的mDCs可激活T淋巴細(xì)胞，使之分化為輔助性T細(xì)胞Th1，Th2和CTL。mDCs捕捉到抗原后，便改變功能，轉(zhuǎn)而移出淋巴結(jié)（圖4.8 ）。當(dāng)抗原和佐劑偶然的刺激mDC，使之成熟時(shí)，MHC的抗原提呈作用就被增強(qiáng)了。有報(bào)道稱，存在于mDC中的佐劑可促進(jìn)協(xié)同刺激分子和MHC分子的上調(diào)節(jié)作用，趨化因

56、子受體表達(dá)作用，抗原提呈能力，細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，mDCs表面的TLRs參與以上重要的過(guò)程，從而激活淋巴細(xì)胞。也有報(bào)道稱，mDC響應(yīng)TLR激活產(chǎn)生IL-6，而IL-6抑制了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，NK和NKT細(xì)胞在響應(yīng)TLR介導(dǎo)的mDC成熟過(guò)程中被激活。在mDC成熟過(guò)程中，會(huì)分裂出專職于細(xì)胞增殖的記憶細(xì)胞，這種作用是建立在與mDCs表面TLR信號(hào)連接的基礎(chǔ)上。外源性的抗原經(jīng)過(guò)交叉激活作用過(guò)程，被MHC I型分子提呈，而不能進(jìn)入mDCs的細(xì)胞質(zhì)。TLR信號(hào)也可以促進(jìn)mDC中的交叉激活作用，它可以強(qiáng)有力的誘導(dǎo)CTL的MHC限制性，來(lái)抵御噬菌作用過(guò)程的抗原。這種由TLR指導(dǎo)的交叉激活作用將在后面的

57、部分進(jìn)行更多的討論。微生物模式（分子）和抗原同時(shí)刺激DC，可引起強(qiáng)的免疫激活作用，更值得注意的是，DC的亞型表面可表達(dá)不同的受體，這使得它們可以對(duì)各種特定的病原體產(chǎn)生應(yīng)答。另外，mDC還有許多微生物特異性吞噬作用受體，包括外源凝集素，Ig超家族和補(bǔ)體受體。mDC中TLRs的功能和那些細(xì)胞內(nèi)的吞噬作用受體對(duì)于描述DC識(shí)別系統(tǒng)是非常重要的。各種TLRs和它們的聚合物對(duì)各種免疫應(yīng)答的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步闡明。 圖4.8 mDC成熟后，各種淋巴細(xì)胞被激活情況。圖中顯示了人TLRs在mDC成熟過(guò)程中的作用。吞噬以后的外源抗原和模式分子（也稱佐劑）定位于未成熟的樹(shù)突細(xì)胞的局部組織，引起這種細(xì)胞的成熟。在m

58、DC的成熟過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生了IFNs、細(xì)胞因子和趨化因子、協(xié)同刺激分子的上調(diào)節(jié)物、激活NK細(xì)胞的配體（ULBP、MIC等）和MHC，并激活了各種淋巴細(xì)胞。這些作用很大程度上依賴于佐劑的性能。同時(shí)，佐劑也可能參與mDCs誘導(dǎo)CD8+CTL產(chǎn)生的過(guò)程中一些必要的機(jī)制，而這些機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。 三、接頭分子的功能接頭分子的功能 至今為止，我們?cè)谌撕托∈蠹?xì)胞中共發(fā)現(xiàn)了四種接頭分子，MyD88，Mal/TIRAP，TICAM-1（TRIF）和TICAM-2（TRAM）。這些接頭分子都包含有TIR結(jié)構(gòu)域（圖4. 10）。研究了這些接頭分子的功能后發(fā)現(xiàn)，以單個(gè)模式分子刺激mDC時(shí)，這種刺激作用可被不同類型的接

59、頭分子所傳感，從而輸出不同的信號(hào)。表達(dá)于細(xì)胞表面的TLR亞組，其主要功能是通過(guò)接頭分子MyD88激活NF-B（圖4. 9）。而TLR4是個(gè)例外，它可同時(shí)激活NF-B和IRF-3，與此不同的是，可識(shí)別核酸的TLRs-TLR3，7和9，并可以激活I(lǐng)FN 激活劑?，F(xiàn)將這些與mDC（如抗原提呈細(xì)胞）激活相關(guān)的接頭分子的特性概述如下：MyD88從事于NF-B和p38MAPK的激活，但在mDC中沒(méi)有誘導(dǎo)產(chǎn)生I型IFN的能力。MyD88可通過(guò)選擇性的連接形式來(lái)調(diào)節(jié)MyD88接頭分子的活性。Mal/TIRAP可將TLR2/4的TIR結(jié)構(gòu)域與MyD88連接起來(lái)，Mal/TIRAP本身也展示出弱的NF-B激活活性

60、，Mal/TIRAP的功能可通過(guò)蛋白質(zhì)水解來(lái)調(diào)節(jié)。 圖4.9人的TLRs與各種不同的接頭分子結(jié)合，決定了各種TLR特有的信號(hào)途徑。圖中描述了與TLR2、TLR3和TLR4相連接的TIR結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)接頭分子的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。由每個(gè)TLR和接頭分子組成的復(fù)合物可傳遞激活到NF-B和IFN-激活劑（IRF-3）的TLR信號(hào)。在pDC中，當(dāng)誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-后，MyD88依賴途徑中IRF-7被激活，同時(shí)，TLR7或9也被激活了，圖中最上面的是TLRs的代表性配體。 圖4.10人DCs中的TLR接頭分子及其可能誘導(dǎo)的信號(hào)。MyD88和TICAM-1是激活NF-B和IFN-I激活劑的功能接頭分子，圖中還顯示了剛