細(xì)胞融合操作規(guī)程1

1、細(xì)胞融合一、 實(shí)驗(yàn)材料手術(shù)剪，鑷子，離心機(jī)，蠟盤等。二、 實(shí)驗(yàn)所配試劑1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液：取一包1640干粉，溶于1000 mL雙蒸水中，慢慢加入2.5 g NaHCO3，0.22 m濾膜過濾除菌，分裝，4冰箱保存?zhèn)溆谩Ｇ噫溍顾厝芤海?00×）：取青霉素100萬單位和鏈霉素1 g，無菌溶于100mL已滅菌的三蒸水中，0.22 m濾膜過濾除菌，1 mL/管分裝，-20凍存?zhèn)溆谩?640完全培養(yǎng)液：向1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10的小牛血清和1%青鏈霉素溶液（100×）（為養(yǎng)成良好的操作習(xí)慣，建議不加最好），搖勻，4冰箱保存?zhèn)溆?。HT培養(yǎng)液：在100 mL含15%血清的1640完

2、全培養(yǎng)液中加入1 mL 100×的HT溶液，搖勻，4冰箱保存?zhèn)溆谩AT培養(yǎng)液：在100 mL含15%血清的1640完全培養(yǎng)液中加入2 mL 50×的HAT溶液（使用前HAT有部分白色沉淀應(yīng)充分混勻），搖勻，4冰箱保存?zhèn)溆?。GNK溶液： 準(zhǔn)確稱取KCL 0.4g ，NaCL 8g ，Na2HPO4·2H2O 1.77g(Na2HPO4·12H2O 3.56g)，NaH2PO4·H2O 0.69g(NaH2PO4·2H2O 0.78g)，酚紅0.01g，葡萄糖2g，加DDW 定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH 值至 7.2，115高壓滅菌，4

3、保存?zhèn)溆?。三、?shí)驗(yàn)步驟1.免疫小鼠選擇6-8周齡的Balb/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量50g/只，皮下注射。免疫程序如下：首次免疫：100L抗原+100L弗氏完全佐劑/只加強(qiáng)免疫：100L抗原+100L弗氏不完全佐劑/只，于首免后2周后進(jìn)行。共免疫3次，每次間隔2周。第二次免疫后的第十天斷尾采血（一般尾部采血4L，溶于200L PBS混勻備用）檢測(cè)效價(jià)，如果效價(jià)很低或沒有效價(jià)，建議直接放棄，不用繼續(xù)再免疫。如果效價(jià)可以，在二免后的2周進(jìn)行三免，最后一次免疫10天后，斷尾采血，用適當(dāng)?shù)目乖M(jìn)行包被，用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1:1600以上即可進(jìn)行細(xì)胞融合。超強(qiáng)免疫：最后一次加強(qiáng)免

4、疫后2周，細(xì)胞融合前35天，尾靜脈或腹腔注射50g純抗原。2. 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備融合前1-2 d制備飼養(yǎng)細(xì)胞。取昆明鼠1只致死（收集小鼠血清，以供篩選時(shí)用該血清做陰性對(duì)照），75%酒精消毒體表，無菌手術(shù)剪刀輕輕剝?nèi)バ∈蟮母共科つw，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。然后用5mL注射器和16號(hào)針頭將5mL預(yù)冷的HAT打入小鼠腹腔，輕輕壓擠腹部，重新吸出注入的液體（在吸取過程中為防止污染，避免針頭刺破腸管），收取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。用HAT稀釋至40ml，100uL/孔添加到4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天檢查有無污染情況。3. 細(xì)胞計(jì)數(shù)為保證NS0細(xì)胞在融合時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)和高活

5、力，建議在融合時(shí)前一天給所需的每瓶NS0細(xì)胞換液，以備融合時(shí)使用。80%左右NS0的細(xì)胞計(jì)數(shù)（三次平均數(shù)）：（11.6×105+9×105+3.7×105）/3=8.1×105/mL脾細(xì)胞計(jì)數(shù)6.5×106/mL,大約是40mL有 2.6×108個(gè)細(xì)胞，兩次計(jì)數(shù)相差不大，所以脾細(xì)胞數(shù)可固定為2.6×108個(gè)/40mL。NS0細(xì)胞計(jì)數(shù)：3.7×105個(gè)/mL（70%）9×105個(gè)/mL（80%）11.6×105個(gè)/mL（90%）脾細(xì)胞計(jì)數(shù)：4. 細(xì)胞融合 在40水浴中預(yù)熱GNK溶液、PEG和HAT

6、溶液；免疫小鼠采血并分離血清，然后致死浸泡到酒精中；收集NS0細(xì)胞于50 mL離心管中（為保證高融合率建議大于4瓶90%的NS0細(xì)胞），1000 r/min離心10 min，棄上清，用GNK洗一次；5小鼠脾細(xì)胞的制備依次剪開小鼠皮膚，腹膜暴露腹腔（建議為防止污染，建議至少用兩套手術(shù)刀具，一套用于剝開小鼠外部皮膚和腹膜，另一套用于取出小鼠脾臟），取脾臟放置與尼龍紗布上充分研碎，并用GNK洗下去，收集脾細(xì)胞于50 mL離心管中，1000 r/min離心10 min，棄上清，打散細(xì)胞團(tuán)；將脾細(xì)胞與NS0骨髓瘤細(xì)胞混合于50 mL離心管中，加GNK溶液至40 mL，1000 r/min離心10 min

7、，棄上清，打散細(xì)胞團(tuán)（充分打散細(xì)胞團(tuán)，以保證融合時(shí)的高融合率）；為保證融合時(shí)的溫度可以事先將混勻好的細(xì)胞在40水浴預(yù)熱兩分鐘，然后在另一剛?cè)〕龅?0水浴燒杯中做融合，用1mL或大于1mL吸管將預(yù)熱的50%PEG（pH8.0）滴加到融合管中，邊加邊輕輕搖動(dòng)融合管，1min或80s內(nèi)加完，并繼續(xù)在水浴中緩緩搖動(dòng)融合管1.5min。立即緩慢滴加37預(yù)熱的GNK溶液15mL。加入步驟為：1 mL/30s，3 mL/30s，11 mL/30s。然后慢慢補(bǔ)加GNK溶液至40mL，37水浴靜置5min，1000 r/min離心10 min，棄上清。打散細(xì)胞團(tuán)，加40mL HAT完全培養(yǎng)具吹打混勻，加到含飼養(yǎng)

8、細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100L，置37 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?？寺〖?xì)胞的篩選、轉(zhuǎn)孔及亞克隆一、融合細(xì)胞的培養(yǎng)1、融合后的細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日檢查有無污染，如發(fā)現(xiàn)污染立即滴加1%的NaOH。2、一般23d可見小克?。?d時(shí)于出現(xiàn)克隆的孔內(nèi)半量換液（注意：37預(yù)熱HAT培養(yǎng)基）；3、10d左右可以吸取少量上清用于篩選（一般吸取50100µL），并補(bǔ)加等量的HAT培養(yǎng)基（換液時(shí)應(yīng)輕柔，以減少對(duì)克隆細(xì)胞的損傷）；4、14d左右對(duì)所篩選的陽性孔可半量更換HT培養(yǎng)基，同時(shí)對(duì)篩選陽性孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)，準(zhǔn)備克隆化。在篩選過程中將HAT培養(yǎng)基逐漸更換為完全培養(yǎng)

9、基RPMI1640/10。二、篩選（1）包被。將抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每塊酶標(biāo)板以5-20ug抗原為宜（如果抗原為多肽或小分子物質(zhì)，則需要加大包被量，如果是純化病毒根據(jù)病毒的濃度做1:400-1000倍稀釋）。每孔的包被體積為50ul。37包被2h或4包被過夜。（2）封閉。倒掉抗原，拍干酶標(biāo)板孔內(nèi)液體， 5% 脫脂牛奶（PBST溶解）或其它無關(guān)物種血清于37封閉2h，封閉完后可立即使用，也可以洗滌一次置于4密封保存以備后面使用。（3）一抗。封閉完后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，用封閉液1:1稀釋待檢測(cè)克隆孔上清，每孔50ul為宜。同時(shí)做陽性（融合小鼠血清1:500-1000

10、倍稀釋）和陰性（所制備飼養(yǎng)細(xì)胞小鼠血清1:200倍稀釋）及空白對(duì)照（所稀釋抗體用封閉液）和無克隆孔上清對(duì)照。在每塊板子上做好標(biāo)記。37孵育30min。（4）二抗。孵育完一抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，以PBST洗滌3次，每次5min。根據(jù)二抗說明稀釋二抗至適當(dāng)比例，每孔加入50ul，37孵育30min。（5）顯色。孵育完二抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入顯色劑，37顯色5-10min，拍照記錄檢測(cè)結(jié)果，篩選出陽性較強(qiáng)的克隆進(jìn)行特異性檢測(cè)。三、特異性篩選對(duì)篩選的強(qiáng)陽性克隆孔進(jìn)行特異性篩選，如果是用大腸桿菌表達(dá)的蛋白，可以用載體蛋白、正常大腸桿菌上清以及其它無關(guān)蛋白進(jìn)行包板檢測(cè)；如果是細(xì)胞毒免疫的可以用

11、正常細(xì)胞的裂解液包板檢測(cè)；如果是組織毒免疫的可以用正常動(dòng)物組織包板檢測(cè)。其檢測(cè)方法同上，注意設(shè)立對(duì)照組。同時(shí)對(duì)篩選的特異性較強(qiáng)的陽性孔轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)，準(zhǔn)備克隆化。四、陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)孔1、為保證轉(zhuǎn)孔成功，建議當(dāng)96孔板細(xì)胞長至80%時(shí)轉(zhuǎn)孔。2、按常規(guī)方法轉(zhuǎn)孔前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞， 24孔板每孔加入0.5-1ml的飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，第二天檢查有無污染情況。（轉(zhuǎn)孔時(shí)所用培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)孔前所用培養(yǎng)基應(yīng)保持一致）。3、收集待轉(zhuǎn)孔的陽性細(xì)胞上清，做好標(biāo)記保存?zhèn)溆?，添加已預(yù)熱的HAT和HT培養(yǎng)基1:1混合（因此時(shí)96孔板克隆已半量過度到HT培養(yǎng)基）各100ul/孔。4、用200ul移液器輕輕吹下細(xì)胞，為減少

12、對(duì)克隆細(xì)胞的刺激，吹打過程應(yīng)輕柔，然后將細(xì)胞懸液加入至24孔板中，為保證細(xì)胞均勻分布到板底，可以用振蕩器輕輕混勻，做好標(biāo)記。同時(shí)，對(duì)所轉(zhuǎn)孔細(xì)胞補(bǔ)加新的培養(yǎng)基，保留原始孔以避免轉(zhuǎn)孔失敗。五、轉(zhuǎn)孔后的檢測(cè)當(dāng)轉(zhuǎn)孔后細(xì)胞長至50%時(shí)，用ELISA檢測(cè)方法及時(shí)進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)和特異性檢測(cè)，檢測(cè)方法同上，篩選出效價(jià)高和特異性較強(qiáng)的準(zhǔn)備亞克隆。同時(shí)在篩選過程中對(duì)24孔板的細(xì)胞逐步更換至1640完全培養(yǎng)基。六、雜交瘤細(xì)胞的克隆為保證克隆細(xì)胞的活性和數(shù)量，建議當(dāng)待克隆的細(xì)胞孔長至80%時(shí)進(jìn)行有限稀釋。提前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，收集待轉(zhuǎn)孔細(xì)胞的培養(yǎng)上清保存?zhèn)溆?，加入已預(yù)熱1640不完全培養(yǎng)基1ml（其目的是該孔細(xì)胞被有限

13、稀釋后可以凍存該孔細(xì)胞。凍存方法為：直接吸取500 ul該孔細(xì)胞懸液，再加入400 ul胎牛血清和100 ul DMSO混勻，1ml/管，做好標(biāo)記，按照正常程序凍存細(xì)胞），輕輕吹打混勻細(xì)胞，取出少許細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用有限稀釋法對(duì)陽性孔的融合細(xì)胞進(jìn)行克隆化。其步驟如下：1、用10ul臺(tái)盼藍(lán)和10ul細(xì)胞懸液于PCR管中等比例混合后，在顯微鏡下進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)公式：細(xì)胞數(shù)/mL = N/4 ×103×10×稀釋倍數(shù)（N為顯微鏡下四角4個(gè)大方格的活細(xì)胞總數(shù)）來計(jì)算每毫升細(xì)胞懸液所含的活細(xì)胞數(shù)，然后取適量的細(xì)胞懸液，用1640培養(yǎng)基（此時(shí)24孔板克隆細(xì)胞過度到那種培養(yǎng)基就用那種培養(yǎng)基做有限稀釋）稀釋到10mL，并且要含有2×103個(gè)活細(xì)胞（稀釋度）； 2、取1mL稀釋度的細(xì)胞懸液加9mL1640完全培養(yǎng)基（稀釋度）；3、取3mL稀釋度的細(xì)胞懸液加7mL1640完全培養(yǎng)基（稀釋度）；4、用稀釋度的細(xì)胞懸液鋪板半塊96孔板，100µL/孔，20個(gè)細(xì)胞/孔；用稀釋度的細(xì)胞懸液鋪板另半塊96孔板，100µL/孔，2個(gè)細(xì)胞/孔；用稀釋度的細(xì)胞懸液鋪一塊96孔板，100µL/孔，0.6個(gè)細(xì)胞/孔；5、將上述培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后，對(duì)單克隆孔進(jìn)行標(biāo)