細胞融合操作規(guī)程1

1、細胞融合一、 實驗材料手術(shù)剪，鑷子，離心機，蠟盤等。二、 實驗所配試劑1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液：取一包1640干粉，溶于1000 mL雙蒸水中，慢慢加入2.5 g NaHCO3，0.22 m濾膜過濾除菌，分裝，4冰箱保存?zhèn)溆?。青鏈霉素溶液?00×）：取青霉素100萬單位和鏈霉素1 g，無菌溶于100mL已滅菌的三蒸水中，0.22 m濾膜過濾除菌，1 mL/管分裝，-20凍存?zhèn)溆谩?640完全培養(yǎng)液：向1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10的小牛血清和1%青鏈霉素溶液（100×）（為養(yǎng)成良好的操作習慣，建議不加最好），搖勻，4冰箱保存?zhèn)溆?。HT培養(yǎng)液：在100 mL含15%血清的1640完

2、全培養(yǎng)液中加入1 mL 100×的HT溶液，搖勻，4冰箱保存?zhèn)溆?。HAT培養(yǎng)液：在100 mL含15%血清的1640完全培養(yǎng)液中加入2 mL 50×的HAT溶液（使用前HAT有部分白色沉淀應充分混勻），搖勻，4冰箱保存?zhèn)溆?。GNK溶液： 準確稱取KCL 0.4g ，NaCL 8g ，Na2HPO4·2H2O 1.77g(Na2HPO4·12H2O 3.56g)，NaH2PO4·H2O 0.69g(NaH2PO4·2H2O 0.78g)，酚紅0.01g，葡萄糖2g，加DDW 定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH 值至 7.2，115高壓滅菌，4

3、保存?zhèn)溆?。三、實驗步驟1.免疫小鼠選擇6-8周齡的Balb/c雌性小鼠進行免疫，免疫劑量50g/只，皮下注射。免疫程序如下：首次免疫：100L抗原+100L弗氏完全佐劑/只加強免疫：100L抗原+100L弗氏不完全佐劑/只，于首免后2周后進行。共免疫3次，每次間隔2周。第二次免疫后的第十天斷尾采血（一般尾部采血4L，溶于200L PBS混勻備用）檢測效價，如果效價很低或沒有效價，建議直接放棄，不用繼續(xù)再免疫。如果效價可以，在二免后的2周進行三免，最后一次免疫10天后，斷尾采血，用適當?shù)目乖M行包被，用間接ELISA檢測抗體效價，效價達到1:1600以上即可進行細胞融合。超強免疫：最后一次加強免

4、疫后2周，細胞融合前35天，尾靜脈或腹腔注射50g純抗原。2. 飼養(yǎng)細胞的制備融合前1-2 d制備飼養(yǎng)細胞。取昆明鼠1只致死（收集小鼠血清，以供篩選時用該血清做陰性對照），75%酒精消毒體表，無菌手術(shù)剪刀輕輕剝?nèi)バ∈蟮母共科つw，以防止剪破腹膜，暴露腹膜。然后用5mL注射器和16號針頭將5mL預冷的HAT打入小鼠腹腔，輕輕壓擠腹部，重新吸出注入的液體（在吸取過程中為防止污染，避免針頭刺破腸管），收取小鼠腹腔巨噬細胞。用HAT稀釋至40ml，100uL/孔添加到4塊96孔細胞培養(yǎng)板中，置37 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天檢查有無污染情況。3. 細胞計數(shù)為保證NS0細胞在融合時達到最佳狀態(tài)和高活

5、力，建議在融合時前一天給所需的每瓶NS0細胞換液，以備融合時使用。80%左右NS0的細胞計數(shù)（三次平均數(shù)）：（11.6×105+9×105+3.7×105）/3=8.1×105/mL脾細胞計數(shù)6.5×106/mL,大約是40mL有 2.6×108個細胞，兩次計數(shù)相差不大，所以脾細胞數(shù)可固定為2.6×108個/40mL。NS0細胞計數(shù)：3.7×105個/mL（70%）9×105個/mL（80%）11.6×105個/mL（90%）脾細胞計數(shù)：4. 細胞融合 在40水浴中預熱GNK溶液、PEG和HAT

6、溶液；免疫小鼠采血并分離血清，然后致死浸泡到酒精中；收集NS0細胞于50 mL離心管中（為保證高融合率建議大于4瓶90%的NS0細胞），1000 r/min離心10 min，棄上清，用GNK洗一次；5小鼠脾細胞的制備依次剪開小鼠皮膚，腹膜暴露腹腔（建議為防止污染，建議至少用兩套手術(shù)刀具，一套用于剝開小鼠外部皮膚和腹膜，另一套用于取出小鼠脾臟），取脾臟放置與尼龍紗布上充分研碎，并用GNK洗下去，收集脾細胞于50 mL離心管中，1000 r/min離心10 min，棄上清，打散細胞團；將脾細胞與NS0骨髓瘤細胞混合于50 mL離心管中，加GNK溶液至40 mL，1000 r/min離心10 min

7、，棄上清，打散細胞團（充分打散細胞團，以保證融合時的高融合率）；為保證融合時的溫度可以事先將混勻好的細胞在40水浴預熱兩分鐘，然后在另一剛?cè)〕龅?0水浴燒杯中做融合，用1mL或大于1mL吸管將預熱的50%PEG（pH8.0）滴加到融合管中，邊加邊輕輕搖動融合管，1min或80s內(nèi)加完，并繼續(xù)在水浴中緩緩搖動融合管1.5min。立即緩慢滴加37預熱的GNK溶液15mL。加入步驟為：1 mL/30s，3 mL/30s，11 mL/30s。然后慢慢補加GNK溶液至40mL，37水浴靜置5min，1000 r/min離心10 min，棄上清。打散細胞團，加40mL HAT完全培養(yǎng)具吹打混勻，加到含飼養(yǎng)

8、細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔100L，置37 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?？寺〖毎暮Y選、轉(zhuǎn)孔及亞克隆一、融合細胞的培養(yǎng)1、融合后的細胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日檢查有無污染，如發(fā)現(xiàn)污染立即滴加1%的NaOH。2、一般23d可見小克??；7d時于出現(xiàn)克隆的孔內(nèi)半量換液（注意：37預熱HAT培養(yǎng)基）；3、10d左右可以吸取少量上清用于篩選（一般吸取50100µL），并補加等量的HAT培養(yǎng)基（換液時應輕柔，以減少對克隆細胞的損傷）；4、14d左右對所篩選的陽性孔可半量更換HT培養(yǎng)基，同時對篩選陽性孔的細胞轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)，準備克隆化。在篩選過程中將HAT培養(yǎng)基逐漸更換為完全培養(yǎng)

9、基RPMI1640/10。二、篩選（1）包被。將抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每塊酶標板以5-20ug抗原為宜（如果抗原為多肽或小分子物質(zhì)，則需要加大包被量，如果是純化病毒根據(jù)病毒的濃度做1:400-1000倍稀釋）。每孔的包被體積為50ul。37包被2h或4包被過夜。（2）封閉。倒掉抗原，拍干酶標板孔內(nèi)液體， 5% 脫脂牛奶（PBST溶解）或其它無關(guān)物種血清于37封閉2h，封閉完后可立即使用，也可以洗滌一次置于4密封保存以備后面使用。（3）一抗。封閉完后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，用封閉液1:1稀釋待檢測克隆孔上清，每孔50ul為宜。同時做陽性（融合小鼠血清1:500-1000

10、倍稀釋）和陰性（所制備飼養(yǎng)細胞小鼠血清1:200倍稀釋）及空白對照（所稀釋抗體用封閉液）和無克隆孔上清對照。在每塊板子上做好標記。37孵育30min。（4）二抗。孵育完一抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，以PBST洗滌3次，每次5min。根據(jù)二抗說明稀釋二抗至適當比例，每孔加入50ul，37孵育30min。（5）顯色。孵育完二抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入顯色劑，37顯色5-10min，拍照記錄檢測結(jié)果，篩選出陽性較強的克隆進行特異性檢測。三、特異性篩選對篩選的強陽性克隆孔進行特異性篩選，如果是用大腸桿菌表達的蛋白，可以用載體蛋白、正常大腸桿菌上清以及其它無關(guān)蛋白進行包板檢測；如果是細胞毒免疫的可以用

11、正常細胞的裂解液包板檢測；如果是組織毒免疫的可以用正常動物組織包板檢測。其檢測方法同上，注意設(shè)立對照組。同時對篩選的特異性較強的陽性孔轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)，準備克隆化。四、陽性細胞的轉(zhuǎn)孔1、為保證轉(zhuǎn)孔成功，建議當96孔板細胞長至80%時轉(zhuǎn)孔。2、按常規(guī)方法轉(zhuǎn)孔前一天制備飼養(yǎng)細胞， 24孔板每孔加入0.5-1ml的飼養(yǎng)細胞懸液，第二天檢查有無污染情況。（轉(zhuǎn)孔時所用培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)孔前所用培養(yǎng)基應保持一致）。3、收集待轉(zhuǎn)孔的陽性細胞上清，做好標記保存?zhèn)溆茫砑右杨A熱的HAT和HT培養(yǎng)基1:1混合（因此時96孔板克隆已半量過度到HT培養(yǎng)基）各100ul/孔。4、用200ul移液器輕輕吹下細胞，為減少

12、對克隆細胞的刺激，吹打過程應輕柔，然后將細胞懸液加入至24孔板中，為保證細胞均勻分布到板底，可以用振蕩器輕輕混勻，做好標記。同時，對所轉(zhuǎn)孔細胞補加新的培養(yǎng)基，保留原始孔以避免轉(zhuǎn)孔失敗。五、轉(zhuǎn)孔后的檢測當轉(zhuǎn)孔后細胞長至50%時，用ELISA檢測方法及時進行效價檢測和特異性檢測，檢測方法同上，篩選出效價高和特異性較強的準備亞克隆。同時在篩選過程中對24孔板的細胞逐步更換至1640完全培養(yǎng)基。六、雜交瘤細胞的克隆為保證克隆細胞的活性和數(shù)量，建議當待克隆的細胞孔長至80%時進行有限稀釋。提前一天制備飼養(yǎng)細胞，收集待轉(zhuǎn)孔細胞的培養(yǎng)上清保存?zhèn)溆?，加入已預熱1640不完全培養(yǎng)基1ml（其目的是該孔細胞被有限

13、稀釋后可以凍存該孔細胞。凍存方法為：直接吸取500 ul該孔細胞懸液，再加入400 ul胎牛血清和100 ul DMSO混勻，1ml/管，做好標記，按照正常程序凍存細胞），輕輕吹打混勻細胞，取出少許細胞懸液進行計數(shù)，采用有限稀釋法對陽性孔的融合細胞進行克隆化。其步驟如下：1、用10ul臺盼藍和10ul細胞懸液于PCR管中等比例混合后，在顯微鏡下進行活細胞計數(shù)根據(jù)公式：細胞數(shù)/mL = N/4 ×103×10×稀釋倍數(shù)（N為顯微鏡下四角4個大方格的活細胞總數(shù)）來計算每毫升細胞懸液所含的活細胞數(shù)，然后取適量的細胞懸液，用1640培養(yǎng)基（此時24孔板克隆細胞過度到那種培養(yǎng)基就用那種培養(yǎng)基做有限稀釋）稀釋到10mL，并且要含有2×103個活細胞（稀釋度）； 2、取1mL稀釋度的細胞懸液加9mL1640完全培養(yǎng)基（稀釋度）；3、取3mL稀釋度的細胞懸液加7mL1640完全培養(yǎng)基（稀釋度）；4、用稀釋度的細胞懸液鋪板半塊96孔板，100µL/孔，20個細胞/孔；用稀釋度的細胞懸液鋪板另半塊96孔板，100µL/孔，2個細胞/孔；用稀釋度的細胞懸液鋪一塊96孔板，100µL/孔，0.6個細胞/孔；5、將上述培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后，對單克隆孔進行標