靶向MRP基因pRNATH以及shuttleRFP重組質(zhì)粒表達載體構(gòu)建設(shè)計

1、齊 齊 哈 爾 大 學(xué)畢業(yè)設(shè)計（論文）題 目 靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達載體構(gòu)建摘 要癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢?；熥鳛槠涑Ｒ?guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。腫瘤細胞的多藥耐藥性（multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致腫瘤細胞化療失敗的主要原因。腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的過度表達是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。RNA干擾(RNA interference

2、，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達的技術(shù)，如能通過RNAi技術(shù)沉默MDR1基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。目的：本課題選用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表達穿梭載體。構(gòu)建針對mrp1 mRNA的RNA干擾表達載體。方法：將預(yù)先根據(jù)MRP1基因序列設(shè)計合成的編碼siRNA的cDNA序列與pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建靶向mrp1 siRNA重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5后大量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落 PCR和 DNA測序分析檢測重組載體構(gòu)建結(jié)果。結(jié)果：成功構(gòu)建靶向MRP1基因pR

3、NAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達載體。為下一步抑制mrp1基因在腫瘤細胞中的表達奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：RNA干擾；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒；穿梭載體 AbstractCancer, a serious threat to human health, the incidence are on the rising trend. Chemotherapy as the routine clinical therapy of tumor, which is an irreplaceable way in cancer treatment. MDR

4、of tumor cell cause the failure of chemotherapy treatment . The reason causing the cancer MDR is relatively complicated, and the excessively expression of multidrug resistance-associated protein 1(MRP1) is one of the reasons causing MDR. Silencing MDR1 gene by RNAi, we can improve the effect of chem

5、otherapy by decrease the level of MDR.Objective: In this study, pRNAT-H1.1/shuttle-RFP plasmid was selected to construct the RNAi expression vector of mrp1 mRNA.Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned into pRNAT-H1.1/shuttle-RFP vector to construct rec

6、ombinant vector. Transformed the recombinant vector into E.coli DH5. The result of recombinant vector was analyzed and identified using PCR and DNA sequencing .Results: Constructing pRNAT-H1.1/shuttle-RFP recombinant plasmid expression vector was constructed successfully. It may be the foundation of

7、 restrain the expression of MRP1 gene in cancer cells.Key Words：RNA interference；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP plasmid；shuttle vector目 錄摘 要IAbstractII第1章 緒 論11.1 RNAi的研究進展11.1.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)過程11.1.2 RNAi的分子作用機制21.1.3 RNAi的特點31.1.4 siRNA簡介31.1.5 siRNA的設(shè)計原則31.1.6 RNAi在抗腫瘤方面的研究41.2 用于RNAi的載體4載體的選擇51.2.2 質(zhì)粒人工構(gòu)

8、建的目的51.3 MRP1的研究進展51.3.1 MRP的轉(zhuǎn)運底物、組織分布及生理作用61.3.2 MRP在組織中的表達61.4 基因治療71.5 本課題在國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀71.6 本論文的研究目的及意義81.7 本論文的主要內(nèi)容8第2章 實驗材料與方法92.1 實驗材料92.1.1 宿主菌92.1.2 質(zhì)粒載體92.1.3 載體通用引物112.1.4 主要試劑及工具酶112.1.5 主要儀器122.2 實驗方法132.2.1 shRNA的設(shè)計與退火132.2.2 合成干涉片段的退火162.2.3 重組載體的構(gòu)建17菌落PCR初步篩選陽性重組子202.2.5 測序鑒定重組載體212.2.6 重

9、組質(zhì)粒大提的OD值檢測21第3章 結(jié)果與分析223.1 質(zhì)粒經(jīng)Hind和BamHI雙酶切后膠回收結(jié)果223.1.1 質(zhì)粒經(jīng)Hind和BamHI雙酶切后結(jié)果223.1.2 目的片段的回收233.2 重組載體的菌落PCR243.3 重組質(zhì)粒大量提取253.4 重組質(zhì)粒測序結(jié)果26討 論294.1 菌落PCR鑒定重組294.2 重組質(zhì)粒穿梭載體的構(gòu)建29結(jié) 論30參考文獻31致 謝34第1章 緒 論1.1 RNAi的研究進展RNA干擾(RNA interference , RNAi)是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，為一種雙鏈RNA分子在mRNA 水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達的過程，是

10、一項新興的基因阻斷技術(shù)。RNAi有望成為分析人類基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。 RNAi的發(fā)現(xiàn)過程1990年，Rich Jorgensan 和他的同事在對矮牽牛花進行實驗時，無意中發(fā)現(xiàn)一種奇怪的現(xiàn)象。他們嘗試把pigment-produing這種由強有力的啟動子控制的基因?qū)氚珷颗；ㄒ约由罨ǖ淖仙Y(jié)果卻發(fā)現(xiàn)不但顏色未加深，許多花呈現(xiàn)雜色甚至白色。Rich Jorgensan 把這種現(xiàn)象稱為共同抑制，因為導(dǎo)入了外源性基因，使得和內(nèi)源性基因具有相似功能的基因的表達都被抑制了1。遺憾的是當時這種現(xiàn)象并未引起Jorgensen 的重視。1994年，C

11、ogoni2和Macino采用粗糙脈胞霉進行轉(zhuǎn)基因研究時，發(fā)現(xiàn)真菌中也存在類似的現(xiàn)象，他們稱之為基因抑制，這一現(xiàn)象后來在其它真菌中也相繼被發(fā)現(xiàn)。1995 年 Guo3 等在對線蟲的實驗中發(fā)現(xiàn)，正義 RNA 與反義 RNA 一樣可以阻斷par21 基因的表達，可惜作者同樣對這一現(xiàn)象也沒有更深入的研究，只做了普通的報道。直到 1998年，關(guān)于 RNAi 現(xiàn)象的研究才被人們真正的發(fā)現(xiàn)4。Fire5等將雙鏈 RNA，即正義鏈和反義鏈的混合物，注射到線蟲的體內(nèi)，卻誘發(fā)了比正義鏈或反義鏈的單獨注射效果更強的基因沉默，要徹底使同源基因的表達沉默，在每一個細胞中，只需要很少的幾個分子的雙鏈就可以做到。在接下來

12、進行的實驗中還證實6，將雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)后 ，不但阻斷了線蟲體內(nèi)所有同源基因的表達，同時還沉默了其第 1 代子代的同源基因，他們從此把這種現(xiàn)象命名為 RNAi。隨后，RNAi 現(xiàn)象又陸續(xù)在果蠅、錐形蟲、真菌、渦蟲、植物及斑馬魚等真核生物的研究中被發(fā)現(xiàn)7。這種情況揭示了RNAi現(xiàn)象可能出現(xiàn)于生命進化的早期階段，在RNAi機制發(fā)現(xiàn)之前，不同生物中的RNAi現(xiàn)象有著不同的描述：真菌中稱為“鎮(zhèn)壓”作用，在植物中被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默和基因協(xié)同抑制 8。 RNAi的分子作用機制RNAi的作用機制在眾多學(xué)者的努力研究下日漸明朗。不同生物體內(nèi)的RNA干擾作用機制也各有不同，但是主要可以分為兩種類型：特異

13、效應(yīng)作用機制與非特異效應(yīng)作用機制。特異性效應(yīng)一般發(fā)生在短雙鏈RNA（2123nt）上，非特異性效應(yīng)發(fā)生于長雙鏈RNA（30nt以上）。9。其中，RNAi的特異效應(yīng)作用機制是在多個不同的水平上實現(xiàn)的，包括翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等。其中，轉(zhuǎn)錄后水平RNA干擾的研究最為深入，應(yīng)用也最為廣泛。10.1 特異性效應(yīng)轉(zhuǎn)錄后水平的RNA干擾的發(fā)生機制是在對果蠅、線蟲等生物體進行科學(xué)研究從而進一步推導(dǎo)得出來的。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和RNAi研究的深入，人們對RNAi的作用機制的了解也越來越多，通過生化和遺傳學(xué)研究，現(xiàn)在普遍認為RNAi可能的作用機制主要包括兩個階段：第一步：起始階段，即內(nèi)源或外源dsRN

14、A經(jīng)特定的RNase III 家族的雙鏈特異的核糖核酸酶(Dicer) 以ATP 依賴的方式將長的dsRNA 切割成2123 nt的小干擾RNA；第二步，效應(yīng)階段，即siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC結(jié)合共同降解靶mRNA11。除此之外還有某些研究認為RNAi的作用機制還存在著第三階段循環(huán)放大階段。這是RNAi的自身循環(huán)放大機制，其機制主要是指在效應(yīng)階段，RISC活化后與mRNA結(jié)合，mRNA被內(nèi)切核酸酶切割成大小在l223nt不等的小片段，這些片段可以特異性地阻礙表達靶基因。同時，釋放出來一種可以作為特殊引物的siRNA，從而以靶mRNA為模板在RdRP的作用下，合成新的dsRNA。這

15、種dsRNA可以降解成新的siRNA，在這個循環(huán)中表現(xiàn)出放大效應(yīng) 10。抑制相應(yīng)mRNA的翻譯可阻礙相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達，這就是翻譯水平的RNA干擾機制12，其中stRNA起到了非常的重要作用。轉(zhuǎn)錄水平上的RNA機制是通過siRNA與互補的DNA直接發(fā)生作用，從而加強同源DNA的甲基化，以阻礙目的基因轉(zhuǎn)錄，使表達關(guān)閉，從而強化基因沉默。有文獻談到組蛋白H3及相應(yīng)DNA區(qū)域可被dsRNA誘導(dǎo)甲基化。一旦啟動子區(qū)域出現(xiàn)甲基化，那么轉(zhuǎn)錄將被阻斷，如編碼區(qū)出現(xiàn)甲基化，則可以進行轉(zhuǎn)錄，但在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默。1.1.2.2 非特異效應(yīng)研究表明，長度大于30nt的長雙鏈RNA轉(zhuǎn)染至哺乳動物體內(nèi)，dsRNA會激活

16、雙鏈RNA所依賴的蛋白激酶途徑13，從而導(dǎo)致EIF-2因子磷酸化，進而非特異性地抑制翻譯，誘發(fā)全面的細胞基因沉默。 RNAi的特點RNAi具有高效性，也就是說與細胞內(nèi)的mRNA的量相比，注入細胞內(nèi)的siRNA的量要少得多。但由于循環(huán)放大機制的存在，仍可以有效地阻斷目的基因的表達；同時，RNAi也具有高特異性，小干擾RNA由dsRNA降解得到的，除在序列識別中不起主要作用的正義鏈3端的兩個堿基以外，其余堿基均為必需。任何單個堿基的改變即導(dǎo)致RNAi失效，RNAi能特異性降解mRNA，針對同源基因共有序列的RNAi則可使同源基因全部失活。除此之外，RNAi還具有共抑制性、種屬時效性和dsRNA的長

17、度限制性的特點。 siRNA簡介RNA干擾作用是通過siRNA（small interfering RNA，siRNA）這類小RNA分子作為較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實現(xiàn)的。通過對植物的研究證明，雙鏈RNA復(fù)合體降解為35nt左右的小RNA分子后通過序列互補與mRNA結(jié)合，進而降解mRNA。RNaseIII核酶家族的Dicer是RNA干擾中一個非常重要的酶。它可以結(jié)合到dsRNA上，并剪切其成為2123nt且3'端突出的小分子RNA片斷，形成siRNA。14 siRNA的設(shè)計原則RNAi 作用的成功與否，關(guān)鍵在于siRNA序列的結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)的siRNA序列沉默基因的效率差別很大， 2001年，

18、Elbashir S M等15應(yīng)用化學(xué)合成法合成了siRNA，并發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)哺乳動物發(fā)生RNAi，他們進而據(jù)此提出了siRNA 設(shè)計方法：1) 從起始密碼下游50100nt開始搜索siRNA以避免出現(xiàn)于5或3端的UTRs 的蛋白結(jié)合位點，；2)搜索5AA(N19)UU序列，如果沒有相應(yīng)序列，可以選擇5AA(N21)或5NA(N21)；3)G/C含量在32%79%之間16； 4) 要確定siRNA對靶基因的特異性，可以利用Blast軟件在基因組中進行比對，；5)設(shè)置在基因組中無對應(yīng)序列的siRNA的對照siRNA。但是，Elbashir S M等的設(shè)計方法siRNA 篩選效率仍然很低，要更好的掌

19、握RNAi，提高效率，理性設(shè)計siRNA有效序列成為siRNA 研究的重要方向。目前, 影響siRNA功能的因素包括siRNA序列的結(jié)構(gòu)特點，靶mRNA的空間結(jié)構(gòu)RISC與siRNA的相互作用，以及siRNA與mRNA錯配等17。 RNAi在抗腫瘤方面的研究目前對腫瘤的治療手段主要有藥物化學(xué)治療、手術(shù)切除和放射治療，這些治療方法均無法做到特異性地殺傷及完全根除腫瘤，而且副作用較大。RNAi 具有特異性、簡易性及高效性的特點，可穩(wěn)定沉默突變基因，而對正?；虻谋磉_不產(chǎn)生影響，在腫瘤的研究及治療上有著無法比擬的優(yōu)勢。隨著 RNAi 技術(shù)的不斷成熟，腫瘤的研究有了空前突破，研究的重點主要在有關(guān)腫瘤免

20、疫逃逸、腫瘤性疾病信號傳導(dǎo)的途徑、癌基因及抑癌基因的敲除、提高腫瘤對化療及放療的敏感性等方面18。1.2 用于RNAi的載體基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具，稱為載體。是指能夠運載外源DNA片段（目的基因）進入受體細胞，具有自我復(fù)制能力，使外源DNA片段在受體細胞中得到擴增和表達，不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。載體具有以下的功能：（1）運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞；（2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；（3）為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。目前使用的已知載體除了大腸桿菌中的質(zhì)粒、噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母、細菌人工染色體載體以及動、植

21、物病毒載體等19作為基因工程中使用的載體必須具備以下條件：（1）有復(fù)制起點，在受體細胞中能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制；（2）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點；（3）具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標記基因；（4）分子量小，拷貝數(shù)多；（5）具有較高的外源DNA的載裝能力；（6）安全，不含對受體細胞有害的基因，不會任意轉(zhuǎn)入受體細胞以外的其它生物細胞中。載體按其應(yīng)用范圍，可以分為克隆載體和表達載體。克隆載體是指用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。表達載體是指使目的基因在宿主細胞中得以表達的載體?？蓪⒅亟M體DNA導(dǎo)入適

22、合的受體細胞，使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。載體的選擇質(zhì)粒是為一種1-200kb不等的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子。是染色體外穩(wěn)定遺傳，并能以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中的因子。RNA干擾實驗通常選用質(zhì)粒作為載體。質(zhì)粒載體是為適應(yīng)實驗室操作在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工構(gòu)建的。構(gòu)建的質(zhì)粒載體與天然質(zhì)粒相比通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)，同時可能帶有多個人工合成的單一限制性內(nèi)切酶識別位點。但是，天然質(zhì)粒的缺點是分子量大，拷貝數(shù)低，所以為使分子量盡可能減少，必須去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。20除此之外，質(zhì)粒載體一般還帶有一些可以進行體外轉(zhuǎn)錄外源DNA、鑒定片段的

23、插入方向等用途的序列。21細菌質(zhì)粒是獨立于細菌染色體的自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，只有酵母的殺傷質(zhì)粒已知是RNA分子。環(huán)狀雙鏈DNA分子有三種構(gòu)型。包括兩條鏈的環(huán)狀結(jié)構(gòu)都保持完整的呈超螺旋構(gòu)型的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，雙鏈中有一條鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)完整，只在另一條單鏈上有切口的開環(huán)DNA（ocDNA)以及雙鏈斷裂呈線狀的線狀DNA22。在瓊脂糖凝膠電泳時，同種質(zhì)粒的三種構(gòu)型遷移速率各不相同，超螺旋構(gòu)型的共價閉合環(huán)狀DNA走得最快，其次是線狀DNA，最慢的是開環(huán)DNA。 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，因而不適合用作基因工

24、程的載體，必須對之進行改造構(gòu)建：（1）加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇（2）增加或減少合適的酶切位點，便于重組（3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量（4）改變復(fù)制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件1.3 MRP1的研究進展在1992年多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1又被稱為ABCC1）的識別以及它的起始特征闡明了這種蛋白確實代表了一種選擇性藥物泵。編碼MRP1的cDNA第一次克隆是通過從阿霉素-選擇性的多藥耐藥人腫瘤細胞系（H69R）中篩選差異cDNA得到的。MRP1基因(ABCC1)位于染色體16p13.1上并且編

25、碼含有1531個氨基酸的蛋白。經(jīng)序列分析，將MRP1分為ATP-結(jié)合框超家族中的一員，MDR/P-糖蛋白也屬于這一超家族。MRP1是一個膜整合糖磷蛋白，其表觀分子量為190kDa23,24，一個運用ATP結(jié)合/水解25,26產(chǎn)生的能量，來行使此蛋白主要的有活性的轉(zhuǎn)運功能。 MRP的轉(zhuǎn)運底物、組織分布及生理作用MRP1的底物 直接通過細胞毒性分析和底物刺激的ATP酶測量進行識別MRP1的底物的，底物是由大量的多樣化的疏水復(fù)合物，有機陰離子結(jié)合物以及陰離子非結(jié)合性底物所組成。典型的結(jié)合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合物，MRP1的組織分布 MRP1在體內(nèi)的表達可以說是無所不在。MRP1表

26、達水平最高的組織包括：肺，睪丸，腎，心和胎盤；MRP1的生理作用 MRP1在作為機體主要防線的組織中分布，以及MRP1的底物特異性，表明MRP1有保護機體免受外源生物質(zhì)和內(nèi)源毒性代謝物侵害的生理作用。通過對基因敲除的動物進行研究確定了MRP1的功能。盡管很多體外實驗明確的證實了：MRP1介導(dǎo)外源和內(nèi)源物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。但是幾次嘗試證實MRP1在體內(nèi)的保護作用都沒有成功。 MRP在組織中的表達典型的MDR機制在腫瘤耐藥中起一定作用，但多數(shù)學(xué)者發(fā)現(xiàn)MDR1基因和P-gP在腫瘤中的表達水平并不高，難以解釋NSCIC的高度耐藥。Narasaki等發(fā)現(xiàn)許多癌組織同時表達MRP1和MDR1，但后者表達較低，故認

27、為MRP 1較MDR1能是反映腫瘤多藥耐藥更好的指標。在腫瘤復(fù)雜的耐藥機制中，MRP1和MRP3的過度表達發(fā)揮了重要作用。Oguri等報道在運用鉑類化療藥物后，40例腫瘤患者的MRP5表達較用藥前明顯增高，且伴有MRP1及GSH的升高，故認為MRP5可能與GSH 一起參與MRP1導(dǎo)的多藥耐藥27。1.4 基因治療基因治療是腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的手段之一，所謂基因治療是指利用遺傳或分子生物學(xué)方法將外源基因?qū)松矬w內(nèi)或人體細胞內(nèi)，以彌補所缺失的基因或關(guān)閉、降低異?；虻谋磉_，從而對疾病進行治療?；蛑委熓侵委熌[瘤的新手段，目前共有3種MDR基因治療的策略：將相關(guān)凋亡基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細胞，促使其凋亡；使

28、用反義技術(shù)抑制腫瘤細胞耐藥基因表達；將外源mdr1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入人造血干細胞以提高骨髓對化療藥物的耐藥性。1.5 本課題在國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀多藥耐藥蛋白基因1編碼的多藥耐藥蛋白的過度表達是重要的腫瘤耐藥機制之一。RNAi是一種用dsRNA作為序列特異性的觸發(fā)器指導(dǎo)同源單鏈RNA降解的細胞機制。在最近的研究中顯示特定目的基因的表達可被RNA干擾高效抑制。小干擾RNA(siRNA)作為一種中間介質(zhì)，介導(dǎo)哺乳動物細胞中與之同源基因的沉默 28。RNAi的作為一種經(jīng)濟、快捷、高效的技術(shù)手段，正逐步被應(yīng)用于遺傳性疾病、病毒性疾病以及腫瘤等的基因治療。從1990年，植物學(xué)家對矮牽?；ㄗ⑷爰t色素基因，卻使花變成白

29、色，到1995年Su Guo博士利用線蟲完成的實驗，科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)了RNA干擾的現(xiàn)象，但是并未能對其理論做出合理解釋。直到1998年，Andrew Fire等證實Guo等發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA中污染了微量dsRNA而引發(fā)，Andrew Fire和Craig Mello將這一現(xiàn)象命名為RNAi，并于1998年在Nature上發(fā)表了相關(guān)論文。隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi現(xiàn)象廣泛存在于果蠅，線蟲，斑馬魚，真菌以及植物等生物體內(nèi)，這些生物體利用RNA干擾來抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用。近幾年來RNAi的研究取得了很大進展,2001年它被Science雜志評為

30、十大科學(xué)成就之一,2002年被評為十大科學(xué)成就之首。29自2002年5月以后，先后出現(xiàn)將RNAi技術(shù)應(yīng)用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒（如美國科學(xué)家Mc Caffrey）和癌細胞（如我國徐根興教授）的研究報道。這一發(fā)現(xiàn)提示可以應(yīng)用RNAi技術(shù)來抑制MRP1基因的蛋白表達。Nieth C等（2003）發(fā)現(xiàn)臨床上化學(xué)合成siRNA更適于聯(lián)合治療，可以利用化學(xué)合成的siRNA同時轉(zhuǎn)錄多種MRP相關(guān)基因，如其他ABC轉(zhuǎn)運編碼基因或細胞凋亡編碼基因等，而且也可同時編碼其他致癌基因或血管生成因子進行聯(lián)合治療2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予兩名美國科學(xué)家，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。由于RNAi技術(shù)的

31、高效性和高度特異性，RNAi已成為頗為理想的細胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時代功能基因組學(xué)研究中不可或缺的重要手段，并為基因治療開辟了新的途徑。現(xiàn)RNAi已廣泛應(yīng)用到HIV、病毒性肝炎、基因治療及藥物篩選探索中，對腫瘤細胞多藥耐藥性干擾作用的研究也正在迅速發(fā)展中，隨著研究的深入和發(fā)展，將為MRP細胞的逆轉(zhuǎn)提供一個安全有效的途徑。1.6 本論文的研究目的及意義癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢?；熥鳛槠涑Ｒ?guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。腫瘤細胞的多藥耐藥性是導(dǎo)致腫瘤細胞化療失敗的主要原因。腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白1的

32、過度表達是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。RNA干擾是近年來發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達的技術(shù)，如能通過RNAi技術(shù)沉默MDR1基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。本實驗針對mrp1基因設(shè)計并合成了兩對能編碼siRNA的DNA片段，進而構(gòu)建pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達穿梭載體，為研究以RNAi技術(shù)逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥提供實驗基礎(chǔ)。1.7 本論文的主要內(nèi)容依據(jù)研究的目的及實驗思路，本論文主要內(nèi)容包括1根據(jù)腫瘤細胞的mrp1基因核苷酸序列，按照靶位點的尋找原則，設(shè)計并合成2個編碼shRNA的DNA模板sh-mrp1-1和sh

33、-mrp1-2。2pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒的大量提取。3質(zhì)粒載體經(jīng)Hind 和BamH I雙酶切，并進行膠回收。4載體與設(shè)計合成的干涉片段連接，構(gòu)建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達載體。5用已構(gòu)建的靶向mrp1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重組質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5進行菌落PCR，檢測重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確；重組質(zhì)粒大量提取，進行OD值檢測。第2章 實驗材料與方法2.1 實驗材料 宿主菌E.coli DH5：為感受態(tài)宿主菌由北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司提供。2.1.2 質(zhì)粒載體pRNAT-H1

34、.1/shuttle-RFP質(zhì)粒由華中科技大學(xué)吳政星教授惠贈，該質(zhì)粒源自Genscript公司（Scotch PlamsUSA）。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒特性如下： pRNAT-H1.1/shuttle 是一種腺病毒siRNA穿梭質(zhì)粒，shRNA的表達由人的轉(zhuǎn)錄啟動子H1 Promoter啟動，H1啟動子屬于Pol啟動子，該啟動子總在其下游的固定距離開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，轉(zhuǎn)錄過程遇到45個連續(xù)的U即終止，非常精確；同時CMV Promoter為真核生物啟動子，可在該質(zhì)粒中高效啟動紅色熒光蛋白（Red Fluorescence Protein，RFP）的表達；MCS為多克隆

35、位點。質(zhì)粒圖譜見圖2-1圖2-1 pRNAT-H1.1/shuttle-RFP質(zhì)粒圖譜Fig.2-1 Detailed map of pRNAT-H1.1/shuttle-cRFP2.1.3 載體通用引物正向引物（M13）：5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3反向引物（Rev）：5- GAGTTAGCTCACTCATTAGGC -32.1.4 主要試劑及工具酶質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖猩虾Ｉど锕こ碳夹g(shù)服務(wù)有限司Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司10×PCR buffer北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司dNTP上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司Marker(1

36、kb,100bp)上海生工生物工程技服務(wù)有限公司Goldview DNA染料北京賽百盛基因技術(shù)有限公司吖啶橙北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司氨芐青霉素上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限司EDTABio Basic Inc溶菌酶北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司LiClAmrescoRNaseSigmabacto-typtoneBio Basic Incbacto-yeast extractBio Basic IncPEG8000北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司TriS飽和酚北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司HindNEB公司BamHINEB公司T4DNA連接酶NEB公司Taq酶北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司2.1.4.1

37、 電泳緩沖液及培養(yǎng)基1、 50×TAE電泳緩沖液：Tris堿242g，冰乙酸57.1mL，EDTA（Na2EDTA·2H2O）37.2g溶水，定容至1000mL。2、10×TBE電泳緩沖液：Tris堿54g，硼酸27.5g，EDTA（5M，pH8.0）20ml，ddH2O定容至500ml。3、LB液體培養(yǎng)基：將bacto-typtone 2g、bacto-yeast extract 1g和NaCl 2g，溶于195mL雙蒸H2O，溶解后用5MNaOH調(diào)PH值至7.0，定容至200ml，共配置5份，121濕熱滅菌30min。4、固體選擇培養(yǎng)基（Ampr）：每100m

38、l LB液體培養(yǎng)基中加1.5g瓊脂粉，121濕熱滅菌20min，待溫度降至60加入終濃度為50g/mL的氨芐青霉素，混勻后倒平板，4保存?zhèn)溆谩?.1.4.2 大提質(zhì)粒溶液配置(1)溶液I：50mmol/L C6H12O6，25mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。(2)溶液II：0.2mol/L NaOH，1% SDS。(3)溶液III：5mol/L KAc600mL， 冰乙酸115mL，H2O 285mL。(4)溶菌酶（現(xiàn)用現(xiàn)配）：取0.1g溶菌酶溶于10mL 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）。(5) PEG8000緩沖液：取

39、6.5g PEG8000溶于50mL 1.6mol/L NaCl.。(6) 70%乙醇：取300mL無水乙醇溶于700mL水中。(7) TE（pH8.0）緩沖液：1mol/L Tris-HCl（pH8.0）500L，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）100L，加水至50mL。2.1.5 主要儀器微量振蕩器（MM-2型）上海像華化工有限公司微量振蕩器（MM-2型）上海像華化工有限公司恒溫空氣搖床北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司電子天平北京賽多利斯天平有限公司紫外分析儀（ZF型）上?？等A生化儀器制造廠低溫離心機（SK18）SIGMA公司低溫離心機（SK18）SIGMA公司PCR儀（9600型）

40、ABI恒溫磁力攪拌器（2003-16）常州國華電器有限公司恒溫水浴鍋上海躍進醫(yī)療器械廠自動雙重純水儀上海博通儀器廠2.2 實驗方法 shRNA的設(shè)計與退火 根據(jù)siRNA設(shè)計原則34，根據(jù)MRP1靶序列，設(shè)計合成四對互補反向重復(fù)脫氧核糖核酸序列，中間間隔9nt莖環(huán)序列(TTCAAGAGA)，5端帶有BamH酶切位點，3端帶有Hind酶切位點，用BLAST進行同源性分析，確定與其他基因無同源性。shRNA的DNA模板由上海生工合成，單鏈干涉片段退火后形成雙鏈。干涉靶點在mrp1基因mRNA全序列中的位置如下(粗體代表靶序列)：1 ccaggcggcg ttgcggcccc ggccccggct

41、ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc61 gccgccgccg ccgccgccag cgctagcgcc agcagccggg cccgatcacc cgccgcccgg121 tgcccgccgc cgcccgcgcc agcaaccggg cccgatcacc cgccgcccgg tgcccgccgc181 cgcccgcgcc accggcatgg cgctccgggg cttctgcagc gccgatggct ccgacccgct241 ctgggactgg aatgtcacgt ggaataccag caaccccgac ttcaccaagt gct

42、ttcagaa301 cacggtcctc gtgtgggtgc cttgttttta cctctgggcc tgtttcccct tctacttcct361 ctatctctcc cgacatgacc gaggctacat tcagatgaca cctctcaaca aaaccaaaac421 tgccttggga tttttgctgt ggatcgtctg ctgggcagac ctcttctact ctttctggga481 aagaagtcgg ggcatattcc tggccccagt gtttctggtc agcccaactc tcttgggcat541 caccacgctg ct

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44、ccctgc ccagagtcca gcgcttcctt841 cctgtcgagg atcaccttct ggtggatcac agggttgatt gtccggggct accgccagcc901 cctggagggc agtgacctct ggtccttaaa caaggaggac acgtcggaac aagtcgtgcc961 tgttttggta aagaactgga agaaggaatg cgccaagact aggaagcagc cggtgaaggt1021 tgtgtactcc tccaaggatc ctgcccagcc gaaagagagt tccaaggtgg atgcg

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46、 ctcgtgctgc accagtactt ccacatctgc ttcgtcagtg gcatgaggat1381 caagaccgct gtcattgggg ctgtctatcg gaaggccctg gtgatcacca attcagccag1441 aaaatcctcc acggtcgggg agattgtcaa cctcatgtct gtggacgctc agaggttcat1501 ggacttggcc acgtacatta acatgatctg gtcagccccc ctgcaagtca tccttgctct1561 ctacctcctg tggctgaatc tgggccct

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48、ttca cctgggtctg1861 cacgcccttt ctggtggcct tgtgcacatt tgccgtctac gtgaccattg acgagaacaa1921 catcctggat gcccagacag ccttcgtgtc tttggccttg ttcaacatcc tccggtttcc1981 cctgaacatt ctccccatgg tcatcagcag catcgtgcag gcgagtgtct ccctcaaacg2041 cctgaggatc tttctctccc atgaggagct ggaacctgac agcatcgagc gacggcctgt2101

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56、ttactcattg caggtcacca cgtacttgaa ctggctggtt cggatgtcat ctgaaatgga3961 aaccaacatc gtggccgtgg agaggctcaa ggagtattca gagactgaga aggaggcgcc4021 ctggcaaatc caggagacag ctccgcccag cagctggccc caggtgggcc gagtggaatt4081 ccggaactac tgcctgcgct accgagagga cctggacttc gttctcaggc acatcaatgt4141 cacgatcaat gggggagaaa aggtcggcat cgtggggcgg acgggagctg ggaagtcgtc4201 cctgaccctg ggcttatttc ggatcaacga gtctgccgaa ggagagatca tcatcgatgg4261 catcaacatc gccaagatcg gcctgcacga cctccgcttc aagatcacca tcat