RhoA蛋白在人胃癌細(xì)胞株SGC7901的定位和移位

1、.江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果： (1)內(nèi)源性的RhoA在人胃癌細(xì)胞株SGC7901的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和 細(xì)胞核中均有分布。 (2)外源性的RhoA在人胃癌細(xì)胞株SGC7901的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和 細(xì)胞核中均有分布。 (3)在人胃癌細(xì)胞株SGC一7901的間期細(xì)胞核中，RhoA定位在核仁 區(qū)。(4)在人胃癌細(xì)胞株SGC7901中，RhoA基因沒(méi)有發(fā)生堿基對(duì)突變。 (5)LPA能夠引起RhoA從細(xì)胞漿向細(xì)胞膜和細(xì)胞核移位；CPT-cAMP 能夠引起RhoA從細(xì)胞膜和細(xì)胞核向細(xì)胞漿移位；CPT-cAMP能夠阻斷 LPA引起的RhoA移位。結(jié)論RhoA基因在人胃癌細(xì)胞株SGC7901中沒(méi)有發(fā)生突變。RhoA

2、蛋白 在SGC7901細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有分布，在間期細(xì)胞 核1為RhoA定位于核仁區(qū)；LPA能夠活化RhoA，使其向細(xì)胞膜和細(xì)胞核 移位，CPT-cAMP能夠抑鋁IJRhoA的活性，使其向細(xì)胞漿移位，CPT-cAMP 能夠阻斷LPA弓起的RhoA在細(xì)胞內(nèi)的移位。關(guān)鍵詞：RhoA，定位，移位，核仁，LPA，CPT-cAMP：江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文ABSTRACTobjectiveTo investigate the subceUular localization of RhoA in human Gastric Cancer Cell Line SGC-790 1 and to e

3、lucidate the effects of activity change of RhoA on its translocation within the cellsMethods(1)Immunofluorescenceassay,immunocytochemistryassayand immunoTEM assaywere applied for detecting the localization of endogenous RhoA in human Gastric Cancer Cell Line SGC-7901 (2)Western Blot assay was applie

4、d for detecting endogenous RhoA in different subcellular fractions(membrane，cytosol and nucleus fractions) (3)Human Gastric Cancer Cell Line SGC一790 1 cells were transfected with plasmid DNA encoding different structural RhoA(wt，63L and N19)，andWestern Blot assay was applied for detecting exogenous

5、RhoA in differentsubcellular fractions(membrane，cytosol and nucleus fractions) (4)RhoA(wt，63L and N 19)genes were constructed into pcDNA3 vectors containing GFP gene and the plasmids were transfected into human Gastric Cancer Cell Line SGC一7901 cellsThe localization of exogenous RhoA in living cells

6、 was investigated by laser scanning confocal microscope (5)Human Gastric Cancer Cell LiIle SGC-790 1 cells were treated with Hoechst 33342 for revealing chromatin，and immunofluorescence assay was applied for investigating the precise localization of RhoA in nucleus (6)Western Blot assay was applied

7、for detecting RhoA in nucleoli fractionfrom human Gastric Cancer Cell line SGC790 1 cells(7)The full length of RhoA gene was cloned from human Gastric CancerCell line SGC一7901 cells and the sequence was analyzed(8)Western Blot assay was applied for investigating the translocation of 江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文RhoA i

8、n human Gastric Cancer Cell line SGC一790 1 cells induced by LPA and CPTaMP respectively,and the effect of CPT-a劉MP on LI'Ainduced RhoA translocationResults(1)In human Gastric Cancer Ceu Line SGC一7901，the endogenous RhoAwas localized on membrane，in cytosol and within nucleus(2)ne subcellular loca

9、lization of exogenous RhoA in human Gastric Cancer Cell Line SGC一790 1 includes membrane，cytosol and nucleus (3)In interphase nucleus of human Gastric Cancer Cell Line SGC-7901， the localization of RhoA was in nucleolus(4)In human Gastric Cancer Cell Line sGC-7901，no mutation of RhoAgene was found(5

10、)U，A induced membrane and nucleus translocation of RhoA in gastric cancer cell line SGC-7901；CP創(chuàng)LMP induced cytosol translocation of RhoA in gastric cancer cell line SGC一7901；CPT-創(chuàng)6LMP could block the translocation of RhoA induced by LPAConclusionThe subcellular localizations of RhoA in human Gastri

11、c Cancer Cell Line SGC-7901 were on membrane，in cytosol and within nucleusIn interphase nucleus，RhoA was localized in nucleolusLPA could activateRhoA and induce its translocation towards membrane and nucleusCPT-cAMP could block LfAinduced RhoA translocation and induce its translocation towards cytos

12、ol in SGC790 1KEY WORDS：RhoA，localization，translocation，nucleolus，LPA，CPaMPIV江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文英文縮寫(xiě)索引縮略語(yǔ)英文名稱(chēng)PKAProtein Kinase AG敞GTPase activate proteinGEFguaninenucleotide-exchange factorGDIguanine-nucleotid-dissociation inhibitorSREserum response element吼Lysophosphatidic acid,BSABovine scram albuminDTTDit

13、hiothreitolPMSFPhenylmethan-sulfonyl nuoride口TGisopropyl-beta-D-thiogalactopyranosideGSTglutathione-S-transferaseSDS-PlAGEsodium dodecyl sulfate po|yaeryiamide gel eletrophoresisC盯"42A1VIPAdenosine3',5_cyelicMonophosphate，8-(4一Chlorophenylthio)·，Sodium Salt 同陌Cfluoresecin-5一isothiocyan

14、ateGApDHglyeeraldehyde phosphate dehydrogenaseTEMtransmission electron microscopyV學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定， 同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版， 允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)江蘇大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部 內(nèi)容或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃 描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密口，在年解密后適用本授權(quán)書(shū)。 本學(xué)位論文屬于不保密口。學(xué)位論文作者簽名：陽(yáng)燕指導(dǎo)教師簽名：?否知嘞翔1年6月侈日沙7年廠月拶日獨(dú)創(chuàng)性

15、聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú) 立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中己注明引用的內(nèi)容以外，本論 文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品成果。對(duì)本文 的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本 人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：戶(hù)司燕日期：2007年6月侈日江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章緒論11 RhoA蛋白的亞細(xì)胞定位以及活性對(duì)其細(xì)胞內(nèi)定位的影響111小GTP-結(jié)合蛋白小G口結(jié)合蛋白(Small GTPBinding proteins)，簡(jiǎn)稱(chēng)d,G蛋白，是一類(lèi)能夠 結(jié)合GDPGTP單亞基蛋白質(zhì)，因分子量只有2030KD

16、而得名，具有GTP酶活性，在多種細(xì)胞反應(yīng)中具有開(kāi)關(guān)作用，存在于包括酵母到人的所有真核生物中，形成一 個(gè)由超過(guò)100個(gè)成員組成的蛋白超級(jí)家族。這一超級(jí)家族按照結(jié)構(gòu)分為Ras，Rho，Rab，SarA御Ran五個(gè)家族，第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的d,G蛋白是Ras，它是ras基因的產(chǎn)物。d,G蛋白家族中研究最多的是Pho、Rac和Cdc42。哺乳動(dòng)物中已知的Rho蛋 白家族有：RhoA-E和G，Racl3，Cdc42Hs和5K，以及TCl0等f(wàn)11。所有的小GrrP 結(jié)合蛋白在結(jié)構(gòu)上至少有3055的同源性，而每一家族內(nèi)的蛋白質(zhì)保守性則很 高。典型的小G11P結(jié)合蛋白一般包括：GDPGTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、效應(yīng)分子結(jié)合

17、結(jié)構(gòu) 域以及GTPase活性區(qū)域，有的還有Ca2+或其他小分子結(jié)合區(qū)域。d,G蛋白的共同特點(diǎn)是，當(dāng)結(jié)合了GTP時(shí)即成為活化形式，這時(shí)可作用于下游 效應(yīng)分子使之活化，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；而當(dāng)GTP水解成為GDP時(shí)(自身為GTP酶)則 回復(fù)到非活化狀態(tài)，終止信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞內(nèi)的小G口結(jié)合蛋白一般是無(wú)活性的GDP 結(jié)合狀態(tài)，在收到上游信號(hào)刺激之后，轉(zhuǎn)換為GTP結(jié)合的活性狀態(tài)，激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在合適的時(shí)機(jī)，小G耶結(jié)合蛋白自身帶有的GTPase活性水解GTP為GDP，終止信號(hào)傳遞。它們廣泛的參與調(diào)控諸多細(xì)胞功能。在細(xì)胞中存在著一些專(zhuān)門(mén)控 制小G蛋白活性的d,G蛋白調(diào)節(jié)因子，有的可以增強(qiáng)小G蛋白的活性，如鳥(niǎo)苷

18、酸交 換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)和鳥(niǎo)苷酸解離抑制因子(Guaninenucleotide dissociation Inhibitor，GDI)，有的可以降低d,G蛋白活性，如GTP酶活化 蛋白(GTPase activating protein，GAP)。小G口結(jié)合蛋白調(diào)控細(xì)胞功能是通過(guò)啟 動(dòng)或終止某一特定的細(xì)胞功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的，也即它們的活性決定了某一特定細(xì)胞功能持續(xù)的時(shí)間，因此這類(lèi)蛋白通常又被稱(chēng)為細(xì)胞內(nèi)的“生物計(jì)時(shí)器”(biological timers)。不僅如此，小G口結(jié)合蛋白還在某些蛋白質(zhì)的定位中起著至關(guān)重要的作 用。江蘇大學(xué)

19、碩士學(xué)位論文112RhoA蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布RhoA(Ras homolog A)，是Rasl司N性蛋白，其分子量為21KD左右，Y寸Rlao亞 家族中重要的一員。與Ras蛋白不同，它是作為胞漿蛋白合成的，但是又能夠與細(xì)胞膜相互作用，這種作用是通過(guò)在C末端的CAAX基序的翻譯后異戊二烯化修飾 的特性來(lái)實(shí)現(xiàn)的【2】。Imo亞家族蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要是循環(huán)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿之間，并且大部分與RhoGDP解離抑制因子(RhoGDIs)結(jié)合形成復(fù)合物后定位在細(xì)胞漿。近來(lái)有研究報(bào)道f 3】，Rho家族的某些成員能夠進(jìn)入細(xì)胞核，可能參與調(diào)節(jié)核 功能，對(duì)于這些能夠進(jìn)核的蛋白，它們都需要一個(gè)被稱(chēng)為“核定位信號(hào)”(N

20、LS)的 特異的氨基酸序列，同時(shí)觀察到MLs序列出現(xiàn)在Ras和Rho家族的許多成員的C末 端區(qū)域，并且在進(jìn)化過(guò)程中是很保守的。小G蛋白R(shí)as和Rho家族的NLS序列的發(fā)現(xiàn) 提示了這些蛋白具有了新的功能，即能夠進(jìn)行核漿穿梭。當(dāng)d'G蛋白與其它蛋白結(jié) 合形成大分子復(fù)合物而不能擴(kuò)散通過(guò)核孔的時(shí)候也許需要NLS序列。然而，研究發(fā) 現(xiàn)RhoA蛋白并不具有NLS序列。長(zhǎng)期以來(lái)，眾多的研究資料表明，RhoA蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布主要是在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，且以細(xì)胞漿分布較多【4，5，6】，最近僅我們實(shí)驗(yàn)組明確報(bào)道了"RhoA蛋白在細(xì)胞核內(nèi)有分布71。113RhoA蛋白的活性調(diào)節(jié) 小G蛋白是細(xì)胞內(nèi)重

21、要的信號(hào)分子，具有與GTP和GDP結(jié)合的特性。當(dāng)小G蛋白與GDP結(jié)合后處于無(wú)活性狀態(tài)，而與GTP結(jié)合后處于有活性狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)RhoGTPase的活化需要與能夠影響GDP!，GTP循環(huán)的小分子相互作用。 RhoA蛋白是目前小G蛋白中研究的較多的一種，它與其它小G蛋白一樣，在細(xì)胞內(nèi)存在有與GDP結(jié)合的非活性型和與GTP結(jié)合的活性型兩種狀態(tài)，并且在 二者之間循環(huán)。RhoA蛋白的內(nèi)在GTP酶活性較弱，Rho GAP可增強(qiáng)RhoA蛋白 內(nèi)在的GTP酶活性，從而使GTP水解，導(dǎo)致RhoA處于GDP結(jié)合的非活性形式， 進(jìn)而下調(diào)RhoA活性。RhoA蛋白在非活性及活性狀態(tài)間相互轉(zhuǎn)換時(shí)受多種蛋白因 子的調(diào)節(jié)。近

22、年來(lái)，發(fā)現(xiàn)了多種能夠調(diào)節(jié)RhoA活性的蛋白，如鳥(niǎo)苷交換因子 (GEF)，以及鳥(niǎo)苷解離抑制因子(GDIs)，以及一些RhoA特異性的GAPs，包括2江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文Graf、p190RhoGAP和p122RhoGAP等。 在RhoA蛋白的活性調(diào)節(jié)中，GEF起著重要作用。由于所有發(fā)現(xiàn)的鳥(niǎo)苷交換因子(GEFs)都是蛋白，所以現(xiàn)在稱(chēng)“GEPs”應(yīng)該是比較正確的。GDP的解離是 GDPGTP交換反應(yīng)的限速步驟。這一反應(yīng)非常慢，因而受到GEPs(又稱(chēng)GEF)的刺激，而GEPs本身的活性又受到上游信號(hào)的調(diào)節(jié)。GEP首先與GDP結(jié)合形式的Rho蛋白相互作用，釋放結(jié)合的GDP形成一個(gè)小G蛋白和GEP的二元復(fù)

23、合物。然后， 復(fù)合物中的GEP被GTP取代而形成GTP結(jié)合形式。其主要功能是使RhoA蛋白 由無(wú)活性的GDP結(jié)合狀態(tài)向有活性的GTP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)化，并且只能夠使游離的 GDP結(jié)合形式的RhoA向GTP結(jié)合形式的RhoA轉(zhuǎn)換，而對(duì)于RhoARhoGDI復(fù) 合物中的GDP結(jié)合形式的RhoA不起作用。RhoGEF家族包括Dbl、lbc、lsc、lfc。 GEF家族的蛋白普遍具有兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，即對(duì)轉(zhuǎn)換活性起作用的Dbl同源結(jié)構(gòu) 域(DH)和涉及到細(xì)胞內(nèi)定位的普列克底物同源結(jié)構(gòu)域(PH)。目前己發(fā)現(xiàn)的RhoGEF有：RIP2、pll5RhoGEF、PDZ-GEF、Trio、Duet。 Rho的GDPGr

24、P交換反應(yīng)也受到另一種形式的調(diào)節(jié)因子Rho GDI的調(diào)節(jié)。GDl分子首先在Rab蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制研究過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)。最近，已有兩種經(jīng)典的 GDIs被分離出：D4-GDI(Y,稱(chēng)LY-GDI)，僅在造血組織中表達(dá)【8，9】，和Rho GDIg， 優(yōu)先在腦和胰腺中表達(dá)f101。體外研究表明，D4一GDI對(duì)RhoA，Rac和Cdc42起著 GDI的調(diào)節(jié)作用f111。Rho GDIs對(duì)Rho GTPase在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿之間的移位起 著關(guān)鍵性作用。在靜息細(xì)胞，Rho蛋白與Rho GDIs形成復(fù)合物而存在于細(xì)胞漿中， Rho GDIs能夠抑制GTPGDP交換的速率，但在細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程中，Rho蛋白將與 GDI

25、解離而移位到細(xì)胞膜-：121。RhoGDI通過(guò)兩個(gè)不同的結(jié)合域與RhoA聯(lián)系，一個(gè)是與可變的氨基端結(jié)合阻止鳥(niǎo)苷酸解離，另一個(gè)是與高度折疊的羧基端結(jié)合 來(lái)穩(wěn)定櫳牛兒基化(geranylgeranylation)的RhoA。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，ImoA主要以 無(wú)活性的GDP結(jié)合形式定位于胞漿，與Rho特異的GDI結(jié)合1131。Rho與GDI結(jié)合可以抑制鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)換和Rho GTP酶的活化。114RhoA蛋白的功能 RhoA是Rho家族的重要一員，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。它將信號(hào)從細(xì)胞表面的受體傳送到細(xì)胞內(nèi)的分子靶點(diǎn)，參與了一系列的生物學(xué)進(jìn)程，包括：細(xì)胞形態(tài)改變【14】，遷移【15】，胞質(zhì)分裂【16

26、，17，平滑肌收縮【18，19】和腫瘤侵潤(rùn)【20，21】3江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文等。越來(lái)越多的研究報(bào)道表明，Rho蛋白在癌癥形成過(guò)程中起重要作用，Rho家族 的各個(gè)成員在腫瘤進(jìn)展的不同階段起著不同的作用【22，23，24】。例如，結(jié)構(gòu)活性的 RhoA具有致癌潛能251，盡管RhoA本身的轉(zhuǎn)化能力很弱，但它對(duì)RasRaf通路卻有 較強(qiáng)的協(xié)同作用，是Raus引起的轉(zhuǎn)化過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵介導(dǎo)蛋白f25，261。此外，RhoA促進(jìn)兔肝癌細(xì)胞的入侵【27】和3T3成纖維細(xì)胞的遷移【28】。細(xì)胞在轉(zhuǎn)化過(guò)程中出現(xiàn)的侵入性生長(zhǎng)、細(xì)胞周期改變、基因表達(dá)異常等均與RhoA蛋白有一定關(guān)系。 活性的RhoA介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

27、將具有活性的RhoA蛋白注射入成纖維細(xì)胞中，可以引起肌動(dòng)蛋白纖維形成細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為應(yīng)激纖維，并伴有局部附著斑的形 成。溶血磷脂酸(1ysophosphatidic acid，LPA)可使應(yīng)激纖維快速形成，這一作用可以被RhoA的特異性抑制劑C3外酶所阻斷，因此LPA引起的應(yīng)激纖維的形成是RhoA依賴(lài)性的，然而此過(guò)程并不需要RhoA從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞膜291。研究表明RhoA與細(xì)胞骨架有關(guān)。細(xì)胞骨架的改變可影響到細(xì)胞的形態(tài)。LPA 引起的細(xì)胞骨架收縮需要RhoA蛋白從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞膜301。細(xì)胞骨架的改變不僅與細(xì)胞形態(tài)有關(guān)，而且與細(xì)胞的遷移和黏附有一定聯(lián)系。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵就是癌細(xì)胞侵

28、入性生長(zhǎng)的特性增強(qiáng)，研究表明RhoA活性升高可促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而且C3外酶可以抑制這一反應(yīng)311。RhoA可調(diào)節(jié)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，如SRE，AP1，NFl,B等。例如，凹A等刺激可引起相似的C10s血清反應(yīng)元件的活化，并且這一反應(yīng)能被RhoA抑制劑或RhoA突變體 所阻斷32，331。RhoA與胞質(zhì)分裂有關(guān)。如果RhoA活性受到抑制，細(xì)胞則會(huì)停滯在細(xì)胞周期的G1期34】。Rho活化可促進(jìn)周期依賴(lài)性激酶抑制劑的降解，使細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)DNA合成351。115RhoA蛋白活性改變時(shí)其亞細(xì)胞定位的變化 RhoA蛋白是小分子量GTP結(jié)合蛋白，在GDP結(jié)合的非活性型和GTP結(jié)合的活性型兩種狀態(tài)

29、之間循環(huán)。目前研究表明，RhoA蛋白循環(huán)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜之間，同時(shí)伴隨著GDP結(jié)合形式和GTP結(jié)合形式之間的轉(zhuǎn)換。RhoA蛋白以無(wú)活性的 GDP結(jié)合形式存在于細(xì)胞漿，當(dāng)其移位到細(xì)胞膜上時(shí)則轉(zhuǎn)換為GTP結(jié)合的活性形 式?；A(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的RhoA蛋白一般是以無(wú)活性的GDP結(jié)合狀態(tài)存在，在受4江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文 到上游信號(hào)刺激之后，轉(zhuǎn)換為GTP結(jié)合的活性狀態(tài)，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，作用于 相應(yīng)的下游效應(yīng)分子，如與ROCK結(jié)合，從而介導(dǎo)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。溶血磷脂酸(LPA)，是常用的RhoA激動(dòng)劑，具有激素和生長(zhǎng)因子樣特性， 由激活的血小板或具分泌活性的磷脂酶A2產(chǎn)生和釋放36，371。在多種細(xì)胞中，u，A

30、 可與G蛋白耦連的受體結(jié)合，通過(guò)活化受體的G1213亞基，導(dǎo)致RhoGEFs的活 化；Rho-GEFs可促進(jìn)GDP結(jié)合型RhoA向GTP結(jié)合型RhoA轉(zhuǎn)化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訰hoA38，39，40，41】。研究表明，RhoA常作為U'A的下游信號(hào)調(diào)節(jié)分子而起 作用f421，并且U'A能夠引起RhoA從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞膜。但也有報(bào)道顯示， RhoA的細(xì)胞膜移位并不依賴(lài)于RhoA的活性431。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，是經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)第二信使，調(diào)節(jié)著一系列不同的細(xì)胞 進(jìn)程，如細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、離子通道的傳導(dǎo)、突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和基因轉(zhuǎn)錄。 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，cAMP細(xì)胞內(nèi)的主要靶點(diǎn)是PK

31、A。c6m口PKA信號(hào)通路參與 多種細(xì)胞活動(dòng)。研究表明，PKA對(duì)RhoA功能有抑制作用，這主要是通過(guò)PKA磷酸 化RhoA的188位絲氨酸殘基而實(shí)現(xiàn)的。例如，抑制PKA活性可促進(jìn)RhoA的細(xì)胞膜移位；RhoA與cAVP在影響細(xì)胞形態(tài)上有拮抗作用441；細(xì)胞內(nèi)局部cAMP 濃度的變化可影響RhoA功能f451。一些能升高cAMP的藥物，可使細(xì)胞形態(tài)改變， 同時(shí)伴有肌動(dòng)蛋白解聚，使侵入性生長(zhǎng)受到抑制，cAMP這些效應(yīng)很可能通過(guò)PKA抑制RhoA來(lái)實(shí)現(xiàn)461。研究表IjfJ71，用CPT-cAMP預(yù)處理SGC7901細(xì)胞可以阻斷由u'A引起的 RhoA活化，同時(shí)引起了明顯的ImoAl88位絲

32、氨酸磷酸化，這提示RhoA的188 位絲氨酸磷酸化對(duì)于在SGC7901細(xì)胞中PKA的抑制效應(yīng)是至關(guān)重要的。同時(shí)， LPA和CPT-山口對(duì)于RhoA和RhoGDI的相互結(jié)合都沒(méi)有明顯的影響。當(dāng)LPA 激活RhoA時(shí)，不增加RhoA與RhoGDI的結(jié)合，CPT-cAMP也不改變二者之間的 相互作用。長(zhǎng)期以來(lái)都認(rèn)為RhoA蛋白是分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，而且主要是以無(wú)活性的 GDP結(jié)合狀態(tài)分布在胞漿。有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)用RhoA的激動(dòng)劑LPA(1uM， 37"C，15min)作用NIE15神經(jīng)元細(xì)胞后，ImoA發(fā)生了從細(xì)胞漿到細(xì)胞膜的移位【30】；用對(duì)RhoA的活性具有抑制效應(yīng)的cAMP(1001

33、xM，37"C，30mill)作用NK細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上的RhoA明顯減少，而當(dāng)用cAMP(5001tM，37。C，60 min)作用后，5江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文 細(xì)胞膜上幾乎檢測(cè)不到RhoA471。最近又有研究報(bào)道，cAMPPKA能夠阻斷LPA引起的RhoA向細(xì)胞膜移位481。116 PKA的結(jié)構(gòu)以及功能蛋白激酶A(Protein Kinase八PKA)是普遍存在于動(dòng)物體內(nèi)的一種蛋白激酶。 分子量為150-170kD，由4個(gè)亞基組成，包括兩個(gè)相同的調(diào)節(jié)亞基R和兩個(gè)相同 的催化亞基C49，50。根據(jù)R亞基的不同可分為I型和型。I型PKA被認(rèn)為是可溶性的，因此推測(cè)主要存在于胞漿中；型P

34、KA是典型的顆粒狀，局限于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組分如核膜、線粒體外膜等。 PKA在細(xì)胞中作用廣泛。PKA發(fā)揮功能有賴(lài)于環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，cAMP與R亞基結(jié)合后，可導(dǎo)致PKA構(gòu)象發(fā)生改變，使PKA解離成兩個(gè)帶有CA!VP的 R亞基和兩個(gè)游離C亞基511。此時(shí)，C亞基變得有催化活性，可以磷酸化特異性 底物的絲氨酸和蘇氨酸521。PKA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的形成，對(duì)細(xì)胞遷移有雙向作用，可以抑制細(xì)胞的增 殖，促進(jìn)細(xì)胞的分化，與腫瘤的發(fā)生也有一定關(guān)系。PKA可促使細(xì)胞膜上某些蛋白磷酸化，使膜蛋白構(gòu)型發(fā)生改變，從而調(diào)節(jié)細(xì) 胞膜對(duì)某些物質(zhì)的通透性。cA_MP激活PKA后，可以使定位于細(xì)胞膜上的GTP 結(jié)合形式的R

35、hoA蛋白的188位絲氨酸磷酸化，從而增加了RhoA與GDI的親和 力，使RhoA與細(xì)胞膜解離后分移位到細(xì)胞漿，進(jìn)而終止了由活性RhoA介導(dǎo)的信 號(hào)傳導(dǎo)471。同時(shí)，cAMP激活PKA后，PKA的C亞基進(jìn)入核內(nèi)，可使組蛋白H1、H雄、H3磷酸化。磷酸化的組蛋白由于帶電狀態(tài)和構(gòu)象改變，與DNA結(jié)合松弛而分離，從而解除了組蛋白對(duì)某一段基因的抑制，引起轉(zhuǎn)錄；PKA還可使AP1、 CREB等轉(zhuǎn)錄因子的特定區(qū)域磷酸化，使這些轉(zhuǎn)錄因子依賴(lài)的基因轉(zhuǎn)錄增加【53，54。117 PKA介導(dǎo)的信號(hào)通路和RhoA介導(dǎo)的信號(hào)通路中之間的聯(lián)系目前，PKA抑制RhoA活性機(jī)制的研究引起了人們廣泛的興趣。眾多研究資 料表明

36、，在體內(nèi)或體外PKA均可磷酸化RhoA的188絲氨酸位點(diǎn)。目|j又有資料 顯示47】，PKA只能夠使結(jié)合在細(xì)胞膜上的GTP結(jié)合形式的RhoA發(fā)生188位絲氨酸的磷酸化。PICA作用于RhoA的機(jī)制至少有兩種可能：直接磷酸化RhoA和6江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文改變Dbl蛋白。PKA特異性磷酸化RhoA的188位絲氨酸，這將導(dǎo)致RhoA從細(xì) 胞膜上解離并移位至細(xì)胞漿f551；而另一種可能就是改變Dbl蛋白，這一蛋白能夠 將無(wú)活性的GDP結(jié)合形式的RhoA轉(zhuǎn)換成為有活性的GTP結(jié)合形式的RhoA。 Forskolin是腺苷酸環(huán)化酶的激動(dòng)劑，可使PKA活化并抑制RhoA誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài) 變化及細(xì)胞遷移。Rh

37、oA的磷酸化可促進(jìn)GTP結(jié)合狀態(tài)下的RhoA與RhoGDI形 成復(fù)合物，有資料提示磷酸化的GTP結(jié)合形式RhoA與RhoGDI的親和力較GDP 結(jié)合形式RhoA強(qiáng)，從而使得磷酸化的GTP結(jié)合形式RhoA聚集在胞漿中，很難 與RhoGDI解離，因此PKA磷酸化RhoA使其不能轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，同時(shí)也降低了RhoGEF對(duì)RhoA活性的調(diào)節(jié)561。同時(shí)，研究證實(shí)PKA對(duì)RhoA的抑制作用 也可能通過(guò)異三聚體G蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。常見(jiàn)的異源三聚體GTP結(jié)合蛋白通過(guò)在GDP 和GTP的結(jié)合狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換來(lái)完成對(duì)膜受體介導(dǎo)信號(hào)的反應(yīng)，同樣起“分子開(kāi)關(guān)”作用的另一類(lèi)小分子G蛋白，它們不是直接通過(guò)與激動(dòng)型的G蛋白偶聯(lián)受

38、體(Gprotein-coupled receptor，GPCR)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)其活性的。在高度表達(dá)野生型 Gal3的中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞CHO中，cAMP可使基礎(chǔ)水平的RhoA活性下降，而Gal3 的203蘇氨酸位點(diǎn)突變后cAMP則無(wú)該作用。也就是說(shuō)，cA_IVIP可通過(guò)磷酸化Gal3的蘇氨酸來(lái)降低RhoA的活性571。另外，在黑色素細(xì)胞B16中，cAMP可通過(guò)抑 制Rac活性451，進(jìn)一步抑制RhoA活性，使細(xì)胞骨架被破壞。研究表明，PKA介導(dǎo)的信號(hào)通路在多種細(xì)胞活動(dòng)中對(duì)RhoA介導(dǎo)的信號(hào)通路有拮抗作用。RhoA是應(yīng)激纖維形成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。RhoA活化可促進(jìn)應(yīng)激纖 維(stress fiber

39、)的形成，因而可影響細(xì)胞骨架及細(xì)胞形態(tài)。研究顯示U，A和cAMP 在調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)中可相互拮抗，可能是由于CPTcAMPPKA磷酸化RhoA引起細(xì)胞內(nèi)RhoA和ROCK結(jié)合減少導(dǎo)致的441。 另外，RhoA介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)PKA介導(dǎo)的信號(hào)通路也有拮抗作用。PKA活化引起的腎臟成纖維細(xì)胞形態(tài)的改變可以被LPA逆轉(zhuǎn)，1小時(shí)之內(nèi)細(xì)胞會(huì)變圓， 骨架蛋白可重組形成應(yīng)激纖維。PKA活化可引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生快速變化，預(yù) 先用凝血酶原激活RhoA可以防止PKA引起的細(xì)胞形態(tài)改變441。118核仁及其功能 核仁(nucleolus)見(jiàn)于間期的細(xì)胞核內(nèi)，呈圓球形，一般12個(gè)，也有多達(dá)35個(gè)的。核仁的位置不固定，或

40、位于核中央，或靠近內(nèi)核膜，核仁的數(shù)量和大小因7江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文細(xì)胞種類(lèi)和功能而異。 真核細(xì)胞的核仁于19世紀(jì)早期首次被闡明，是細(xì)胞內(nèi)最早被闡明的細(xì)胞器之一；并于20世紀(jì)60年代，被發(fā)現(xiàn)是核糖體合成的部位。核仁是一動(dòng)態(tài)變化的核 區(qū)域，不斷與細(xì)胞漿和核的其他區(qū)域進(jìn)行著“交流”。核仁的主要功能，如參與rRNA 轉(zhuǎn)錄和加工，核糖體組裝等已經(jīng)得到充分的證實(shí)。此外，也有很多報(bào)道提示核仁 在基因表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵性的作用，如參與某些mRNA的加工，核運(yùn)輸?shù)?，?及許多tRNA的前體也是在核仁進(jìn)行加工的。最近也有資料顯示核仁也在細(xì)胞其他 的進(jìn)程中起作用，如細(xì)胞周期的調(diào)控，細(xì)胞老化以及mRNA的輸出等。核仁

41、具有 高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，這也正反映了其對(duì)發(fā)生在這一細(xì)胞器的各種生物學(xué)活動(dòng)，包括 基因表達(dá)等的錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控。目前，“多功能的”核仁這一概念已被廣泛接受，然 而，在核仁區(qū)域中所發(fā)生的一些生物學(xué)活動(dòng)的分子機(jī)制仍然不完全清楚。目Ij尚 未有報(bào)道顯示RhoA在核仁區(qū)有分布。目前，關(guān)于RhoA蛋白在細(xì)胞核內(nèi)定位少有明確報(bào)道，尤其活性改變對(duì)其在細(xì) 胞核內(nèi)定位的影響尚未有報(bào)道。RhoA蛋白在細(xì)胞內(nèi)的精確定位究竟如何?RhoA 蛋白活性改變對(duì)其在細(xì)胞核內(nèi)分布有何影響?在細(xì)胞核內(nèi)的RhoA活性調(diào)節(jié)過(guò)程中，cAMPPKA信號(hào)通路與I脞瓜hoA信號(hào)通路有怎樣的聯(lián)系?這些都需要進(jìn)一步的研究和證實(shí)。12本論文研究的目的、

42、意義、方法、實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)121研究目的：明確在人胃癌細(xì)胞株SGC7901中RhoA蛋白的亞細(xì)胞定位以 及活性對(duì)其定位的影響。 122研究意義：通過(guò)觀察RhoA活性改變對(duì)其細(xì)胞內(nèi)，尤其是細(xì)胞核內(nèi)分布的 影響，初步闡明細(xì)胞核內(nèi)RhoA蛋白的活性調(diào)節(jié)。 123研究方法及技術(shù)：免疫熒光、免疫組化、細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染、Western blotting、激光共聚焦顯微鏡法、RT-PCR、感受態(tài)菌制備以及質(zhì)粒提取等。124實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：根據(jù)國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)了本論文的實(shí)驗(yàn)方案，其操作線路如下：8江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文人胃癌細(xì)胞株SGC-7901EE標(biāo)記的RhoA構(gòu)建綠色熒光蛋向 (GFP) 標(biāo)記的不同 結(jié)

43、構(gòu)活性的RhoA轉(zhuǎn)染細(xì)胞分另IJ 用LPA，cAMP 以及聯(lián)合作用明確內(nèi)源性和外源性 RhoA蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布探討RhoA蛋向的活性對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)定位，尤其是細(xì)胞核內(nèi)定位的影響9江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章RhoA蛋自在SGC-7901細(xì)胞中的定位RhoA蛋白是小分子量GTP結(jié)合蛋白，是控制細(xì)胞骨架蛋白組合、調(diào)節(jié)基因表達(dá) 等細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分【25，58。RhoA在細(xì)胞內(nèi)的功能受其與下游的 多種效應(yīng)因子相互作用的調(diào)節(jié)，RhoA在細(xì)胞內(nèi)的定位將對(duì)其與相應(yīng)的效應(yīng)因子的相互作用起關(guān)鍵性的影響【25,59，60。因此，明確RhoA在細(xì)胞內(nèi)的定位有著十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)就RhoA蛋白在SG

44、C7901的亞細(xì)胞定位做了進(jìn)一步的研究。21 材料禾口方法211 材料2111細(xì)胞株和菌株 人胃癌上皮細(xì)胞SGC7901由上海細(xì)胞生物所提供。大腸埃希菌DH5a為江蘇大學(xué)臨床檢驗(yàn)所提供。 2112主要試劑小牛血清購(gòu)白蘭州民海生物工程公司；低糖DMEM購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白 酶購(gòu)自Sigma公司；梭華陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廈門(mén)太陽(yáng)馬生物工程有限公司；質(zhì) 粒DNA(pcDNAEE-RhoA,pcDNAEE一63L和pcDNAEE-N19)由加利福尼亞州圣地亞哥大學(xué)Renate Pilz教授友情提供；酵母提取物(yeast extract)、胰蛋白胨(tryptone)購(gòu)自O(shè)xoid公司；發(fā)光劑(E

45、CL-plus)購(gòu)自Amersham Biosciences公 司；異丙基硫代半乳糖苷酶(isopropyl-betaDthiogalactopyranoside，IPTG)購(gòu)自 Merck公司；RhoA抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；牛血清白蛋EI(Bovine serum albuminBSA)購(gòu)自華美生物工程有限公司；亮肽素(Leupeptin)、抑肽酶(Aprotinin)購(gòu) 自Amresco公司；氟化磺酰甲苯(Phenylmethan-sulfonyl fluoride，PMSF)購(gòu)自Merck 公司；羊抗小鼠的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SABC試劑盒為華美 公司產(chǎn)品；

46、PVDF膜購(gòu)自Roche公司；膠片購(gòu)自Kodak公司；X射線攝影暗匣購(gòu)自汕頭市粵華醫(yī)療器械廠；帶有GFP的pcDNA3質(zhì)粒由江蘇大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所 提供；TRIzol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogene公司；PCR產(chǎn)物及膠回收純化試劑 盒購(gòu)自Macherey-Nagel公司；T4連接酶試劑購(gòu)自MBI公司；Taq DNA聚合酶、江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文 核酸內(nèi)切酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自Takara Biotec公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 Qiagen公司。2113其它試劑及材料 無(wú)水乙醇、異丙醇、氯仿等化學(xué)試劑均為分析純。2114主要溶液30丙烯酰胺：299丙烯酰胺和lg N，N一亞甲雙丙烯酰胺溶

47、于100ml ddH20中， 過(guò)濾備用。Tris-HC!(pH 88)：1829¨s堿溶于lOOml ddH20中，濃鹽酸調(diào)pH。Tris-HC!(pH 68)：6059 Tris堿和溶于lOOml ddH20中，濃鹽酸調(diào)pH。 5xTris-甘氨酸電泳緩沖液：1519嘶s堿和949甘氨酸溶于950ml ddH20中，再加入50ml 10的SDS貯存液(wv)。lmolL二硫蘇糖醇(fliT)：20ml 001molL乙醇鈉溶液(pI-152)溶解3099DTT，過(guò)濾后分裝貯存于20。2xSDS-PAGELoadingBuffer：lOOmmolLTris-HCI(pH68)，200

48、mmolLDTT，4SDS(wv)，02溴酚藍(lán)(、)l，v)，20甘油(v)。10SDS貯存液：1009電泳級(jí)的SDS溶解在1000ml ddH20中，加熱至68。C 助溶，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至72。10過(guò)硫酸銨：19過(guò)硫酸銨溶解于10mlddH20中，20。C保存。 轉(zhuǎn)膜緩沖液：589 Tris，299甘氨酸和0379 SDS溶于800ml dd H20中，再加入200ml甲醇。10×TBS：809NaCl，29KCl和309Tris溶解于1000ml dd H20中，濃鹽酸調(diào)節(jié) pH至74。磷酸鹽緩沖液(PBS)：89Nacl，029KCl，1569Na2HP04H20，029KH2

49、P04溶解 于1L dd H20中。TBSfI'：將10xTBS稀釋10倍后以11000比例加入吐溫20即可。 3BSA：03gBSA溶解在10mlTBST中。4多聚甲醛：0049多聚甲醛溶解在lmlPBS中。 03TritonX100：03ml TritonX100溶解在100mlPBS中。 2 M蔗糖溶液：將684克的蔗糖溶于100毫升dd H20中。12江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文裂解液：150mMNaCI，5mMMgCl2，50mMTris·C1(PH74)，1NonidetP-40(NP40)(vv)，lmM二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，D叼，10tgmlApr

50、otinin，10tgmlLeupeptin，lmMPMSF。LB培養(yǎng)基：109胰蛋白胨，59酵母提取物，109 NaCl溶解于1000ml ddH20中，高壓備用。LB平板：109胰蛋白胨，59酵母提取物，109 NaCI，瓊脂粉159溶解于1000ml ddn20中，高壓后澆板備用。50xTAE緩沖液(1L)：2429 Tris堿，571ml冰醋酸，05mmolLEDTA(pH80)100ml，定容至1L。質(zhì)粒提取試劑I：25mmolL TrisHCl(pH 80)，10mmolL EDTA，50mmolL葡萄糖。質(zhì)粒提取試劑II：200mmolL NaOH，1SDS。 質(zhì)粒提取試劑111

51、：3mmoYL醋酸鈉，5mmolL乙酸。 提取細(xì)胞核，細(xì)胞膜和細(xì)胞漿的細(xì)胞裂解液I：10mmolL NaHEPES PH 70，2mmolL EDTA，lmmolL MgCl21mmolL DTr，三種蛋白酶抑制劑(Leupeptin， Aprotinin和PMSF)提取細(xì)胞核和細(xì)胞漿的細(xì)胞裂解液II：20mmolL K-HEPES PH 79，420mmolL NaCI，15mmolL MgCl2,02mmolL EDTA，01mmolL EGTA，25glycerol，三種 蛋白酶抑制劑(Leupeptin，Aprotinin和PMSF)細(xì)胞膜蛋白重懸液：10mmolLNaHEPES PH

52、 70，2mmolLEDTA，lmmolL MgCl21mmolL DTI'，三種蛋白酶抑制劑(Leupeptin，Aprotinin和PMSF)，500mM NaC】1TritonX1 00聚丙烯酰胺凝膠配方：成層膠(m1)10分離膠(rnl)12分離膠(rnl)水21191630丙烯酰胺05172015mMTris-cl(PH88)1313lmMTris-cl(PH68)03810十二烷基硫酸鈉00300500510過(guò)硫酸胺003005005TE哐D000300020002江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文2115主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱：Forma高速冷凍離心機(jī)：Megafuge 10R(HE

53、RAEUS)電泳儀：JimX(BioRad) 熒光顯微鏡：Leica 熒光倒置顯微鏡：Nikon 分子雜交箱：Hybridiser HB3D(TECHNE) PCR儀：Mastercycler Personal(Eppendorf) 凝膠成像及分析系統(tǒng)：SYNGENE(GENE)空氣浴搖床：TH15(JOHANAN 01的) 核酸檢測(cè)儀：BioPhotometer(Eppendorf) 電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司 電熱恒溫干燥箱：ECOCELL 超聲波破碎儀：xL2020 超純水分離系統(tǒng)：PL5243(PAII，) 超低溫冰箱：ULl7903V(Thermo)212方法2121細(xì)胞培養(yǎng)

54、和轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞SGC7901和非洲綠猴胚腎細(xì)胞COS7均用含10NBS的DMEM、并放置在5C02、飽和濕度、37。C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)液每隔兩天更換一 次，細(xì)胞傳代時(shí)用025胰蛋白酶(用lmmolL EDTANa2配制)消化細(xì)胞。每次轉(zhuǎn) 染的前一天，將細(xì)胞消化接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種的數(shù)量應(yīng)保證第二 天轉(zhuǎn)染時(shí)能達(dá)到8090的密度。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照說(shuō)明準(zhǔn)備兩管相應(yīng)體積的不含血清 的培養(yǎng)液，一管加入質(zhì)粒，另一管加入轉(zhuǎn)染試劑，兩管液體逐步混勻，室溫下靜 置1520min后，直接加入細(xì)胞培養(yǎng)皿或板中。12h后更換培養(yǎng)液。2122免疫熒光 將細(xì)胞接種在置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的蓋玻片上，密度為30左右，孵育過(guò)夜后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞用新配的4的多聚甲醛固定4"C過(guò)夜(on)，PBS洗三遍；14江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文用03的TritonX-100作用8rain以使