鎘重金屬對野生稻與栽培稻雜交選育后代種子萌發(fā)

1、 前言實驗設計的思路是參照水稻_OryzasativaL_省略_的重金屬毒害與耐性的分子機理研究_葛才林博士論文的研究框架與結果，如下圖所示。實驗選擇測定的物質有：糖類代謝： 淀粉酶活性與同工酶測定、蘋果酸脫氫酶、細胞色素氧化同工酶分析、甘露聚糖酶、蔗糖酶活性檢測。蛋白質代謝：谷胱甘肽含量測定、蛋白酶活性測定、鎘誘導蛋白合成分析。脂類代謝：丙二醛測定、酯酶測定分析、脂氧合酶同工酶分析?？寡趺笝z測：POD過氧化物酶、SOD超氧物歧化酶、同工酶檢測。鎘重金屬對野生稻與栽培稻雜交選育后代種子萌發(fā)、幼苗形態(tài) 建立的生理影響研究實驗設計從基礎物質代謝（糖類代謝、蛋白代謝、脂類代謝）、抗氧化機制兩大方面進

2、行實驗設計。1、 基礎物質代謝 1、糖類代謝 （1）水稻主要儲藏物質代謝：淀粉 淀粉酶活性與同工酶測定【1】 【實驗結果文獻參考】實驗設計：淀粉酶活性的測定 一、原理 淀粉酶能將淀粉水解成麥芽糖，由于麥芽糖能將3，5-二硝基水楊酸試劑還原成3-氨基-5-硝基水楊酸的橙紅色化合物，且在一定范圍內還原糖的濃度與反應液的顏色成正比，故利用比色法可求出麥芽糖的含量。以5分鐘內每克樣品水解產(chǎn)生麥芽糖的毫克數(shù)表示酶活性的大小。 植物淀粉酶可分為-淀粉酶和-淀粉酶兩種，其中-淀粉酶不耐熱，在溫度70以上易鈍化：而-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下則發(fā)生鈍化。根據(jù)以上特性，可分別測

3、定這兩種淀粉酶的活性。如測定-淀粉酶和-淀粉酶的活性，即為淀粉酶總活性。 二、實驗材料、 儀器 及試劑 1 儀器 ： 20ml具塞試管 移液管 100ml容量瓶 石英砂 研缽 721型分光光度計 離心機 恒溫水箱 離心管 2 試劑 ： （1）1%淀粉溶液：稱1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸餾水煮沸。（臨用時配制） （2）pH5.6檸檬酸緩沖液：A、稱取檸檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、稱取檸檬酸鈉29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml與B液145ml混勻，即為pH5.6的緩沖液。 

4、（3）0.4mol/L氫氧化鈉溶液。 （4）3,5-二硝基水楊酸 試劑 ：取1.0克3,5-二硝基水楊酸，溶于20ml mol/L氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加入30克酒石酸鉀鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋，勿使二氧化碳進入。 （5）麥芽糖標準溶液：稱取0.1000克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，然后定容至100ml，取為1mg/ml麥芽糖標準液。實驗材料：萌發(fā)水稻種子。 三、實驗方法 1酶液的制備：稱取去根萌發(fā)水稻種子2克（含外殼），置研缽中，加1克石英沙研磨成勻漿。用8ml蒸餾水分次洗滌研缽，將勻漿轉入 離心管 中，攪拌均勻后放置

5、1520分鐘（間隔攪拌23次）。3500rpm離心10分鐘，將上清液轉入100ml容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，得粗酶液。 2淀粉酶與-淀粉酶的酶促反應： 取4支10ml具塞刻度 試管 ，編號，按下表加入各液：  將以上各管混勻后，置40水浴準確保溫5分鐘，取出后立即向3、4號 試管 中加入4ml 0.4mol/L NaOH終止酶活性。 3麥芽糖的測定： （1）標準曲線制作：取20ml 刻度試管7 支，編號，分別加入1mg/ml 麥芽糖標準液0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0ml，然后各管加蒸餾水，使體積均達2ml，再向

6、各管加3，5-二硝基水楊酸試劑2ml，置沸 水浴 中煮沸5分鐘，取出后冷卻，用蒸餾水稀釋至20ml，搖勻后在520nm波長下用分光光度計比色，以光密度值為縱坐標，麥芽糖含量為橫坐標繪制標準曲線。 （2）樣品的測定：取以上酶作用后的反應液及對照管中的溶液各2ml，分別放入20ml具塞刻度試管中，加入2ml3，5-二硝基水楊酸試劑，置沸 水浴 中準確煮沸5分鐘，取出冷卻，用 蒸餾 水稀釋至20ml，搖勻在520nm波長下用分光光度計比色，記錄OD值，從麥芽糖曲線中查出相應麥芽糖含量，進行結果計算。 四、結果計算  A為酶反應管中麥芽糖含量，即3，4號管中麥芽

7、糖毫克數(shù)的平均值。 A為對照管中麥芽糖含量，即1，2號管中麥芽糖毫克數(shù)的平均值。參考現(xiàn)代植物生理學實驗指南淀粉酶同工酶檢測【2】（2） 呼吸中的糖相關代謝：蘋果酸脫氫酶 （3） 細胞色素氧化同工酶分析 （4）其他糖代謝檢測 ：*參考現(xiàn)代植物生理學實驗指南#甘露聚糖酶（參考植物激素對水稻種子萌發(fā)過程中_甘露聚糖酶活性的調控_任艷芳 2、 蛋白質代謝 （1）谷胱甘肽含量測定（2） 蛋白酶活性測定參考現(xiàn)代植物生理學實驗指南1999 p149(3） 鎘誘導蛋白合成分析3、脂類代謝（1）脂膜氧化：丙二醛測定*實驗方法參考現(xiàn)代植物生理實驗指南1999 p305 (2) 酯酶測定分析：參考現(xiàn)代植物

8、生理實驗指南#脂氧合酶同工酶（參考水稻種子成熟和萌發(fā)過程中脂氧合酶同工酶活性及其表達水平_汪仁）2、 抗氧機制 1、POD過氧化物酶、SOD超氧物歧化酶、同工酶檢測 【實驗原理】SOD是含金屬輔基的酶，它催化以下反應： 0 2 - +0 2 - + 2H +   H 2 0 2 +0 2 由于超氧陰離子自由基0 2 - 壽命短，不穩(wěn)定，不易直接測定SOD活性,而采用間接的方法。目前常用的方法有3種

9、, 包括氮藍四唑(NBT)光化還原法，鄰苯三酚自氧化法，化學發(fā)光法。本實驗主要介紹光化還原法，其原理是：氮藍四唑在蛋氨酸和核黃素存在條件下，照光后發(fā)生光化還原反應而生成藍色甲腙，藍色甲腙在560nm處有最大光吸收.。SOD能抑制NBT的光化還原，其抑制強度與酶活性在一定范圍內成正比。 試劑:1.50m mol/l pH7.8的磷酸緩沖液(PBS) 。含0.1m mol/l EDTA 2.220m mol/l甲硫氨酸：稱3.2824g甲硫氨酸,用50m mol/l pH7.8的磷酸緩沖液定溶至100ml（現(xiàn)配現(xiàn)用）。 3.1.25m mol/l氯化硝基四氮唑藍（NB

10、T）溶液（現(xiàn)配）：稱NBT 0.102g,用 50m mol/l pH7.8的磷酸緩沖液(PBS)溶解定容至100ml.  4.0.033m mol/l核黃素：稱2.52mg 用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）?！緦嶒灢襟E】1酶液制備稱取植物組織0.5g先加入2.5ml PBS，研磨勻漿后，再加入2.5ml PBS混勻，4下 10000r/min離心15min 上清液即為粗酶液。取部分上清液經(jīng)適當稀釋后用于酶活性測定。2.酶活性測定取10ml小燒杯7只, 3只測定樣品,4只作為對照，按下表加入試計:   試劑用量(ml

11、 )終濃度(比色時)50m mol/l   (PBS)220m mol/l   Met1.25m mol/l NBT0.033m mol/l核黃素酶液總體積        4.05         0.30.3         0.3     0.055.0 13m m

12、ol/l75µ mol/l2.0µ mol/l對照以緩沖液代替酶液  將上述試劑混勻后，1只對照燒杯至于暗處，另3只對照燒杯和樣品一起置于4000lx日光燈下反應20min（要求各管受光一致，溫度高時時間縮短，溫度低時可適當延長）。最后在560nm處測定反應液的光密度。以不照光的對照燒杯作參比，分別測定其他各管的光密度。3.蛋白含量的測定步驟1的上清液經(jīng)適當稀釋后用考馬斯亮藍 G-250法測定蛋白含量.【實驗結果及計算】 SOD活性單位是以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。可按下式計 算SOD活性： SOD總活

13、性=   SOD比活力=SOD總活性/蛋白質總濃度      式中: SOD總活性以 U/gFW,比活力單位以 U/mg蛋白表示 ACK為對照杯(光照)的光吸收值;AE為樣品的光吸收值;V為樣液總體積,V1為測定時樣品用量,W為樣重g.過氧化物酶(POD)活性的測定 【實驗原理】植物體內的黃素氧化酶類代謝產(chǎn)物常包含H 2 0 2 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H 2 0 2 的積

14、累可導致破壞性的氧化作用。過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是清除 H 2 0 2 的重要保護酶，能將H 2 0 2 分解為0 2 和H 2 0, 從而使機體免受H 2 0 2 的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關。(CAT)催化如下反應：              

15、       2 H 2 0 2 →2 H 2 0 + 0 2本實驗通過測定H 2 0 2 的減少量來測定CAT的活性。在H 2 0 2 存在條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔嫓y生成物的含量來測定活性。【試劑藥品1.50m mol/l pH7.0的磷酸緩沖液2.0.3% H 2 0&#

16、160;2: 吸0.5ml 30% H 2 0 2 加入pH7.0的磷酸緩沖液至 50ml3.0.2% 愈創(chuàng)木酚 :秤0.2g愈創(chuàng)木酚加入pH7.0的磷酸緩沖液至 100ml【實驗步驟】 酶液的制備 1.稱取葉片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min 離心15min取部分上清液經(jīng)適當稀釋后用于酶活性測定。 2. CAT 活性的測定在3ml的反應體系中，包括0.3% H 2 0 2  1ml, H 2 0 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液啟動反應，測定波長240nm處的OD降低速度。將每分鐘OD減少0.01定義為1個活力單位。