RNAi 技術原理

1、RNAi的實驗方法細胞生物學樊國達2014.11.14目錄 miRNA的原理及機制 RNAi的機制及與miRNA的關系 RNAi實驗的三大基本路線 RNAi機制的缺陷miRNA的原理 MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約2025個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產生的，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體（RISC），通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒

2、防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。miRNA如何行使功能？與mRNA的3端非編碼區(qū)特定位點(其第28個核苷酸)綁定：與mRNA完全互補時會引發(fā)mRNA降降解解；不完全的與mRNA配對時，會引發(fā)轉錄后的基因沉默基因沉默（抑制抑制靶基因的表達表達）從而抑制或阻止相應的mRNA翻譯過程。miRNA途徑：miRNA可以降解mRNA，或者抑制mRNA翻譯蛋白質RNAi借用了天然的miRNA作用途徑RNAi作用機制RNAi實驗三大基本路線線路一：非哺乳動物細胞體系的RNAi實驗和選擇 比如果蠅，線蟲，擬南芥等低等生物和植物，由于不涉及抗病毒免疫應答反應，通過體外轉錄即可制備目標基因的

3、dsRNA（200bp左右），直接用長雙鏈RNA進行RNAi實驗。（1）構建目的基因載體，選取目的基因的特異性序列（約200bp300bp），構建到T載體上。 （2）使用5端連接有T7啟動子的引物PCR擴增目的基因，得到兩端均連接有T7啟動子 序列的目的基因片段。（3）T7RNA聚合酶進行轉錄。dsRNA、ssRNA、DNA模板。（4）加入Rnase 和Dnase消除ssRNA和DNA模板。（5）離心純化dsRNA。siRNA導入細胞的方法對于線蟲而言，線路二：哺乳動物細胞RNAi實驗：siRNA的設計，合成哺乳動物細胞導入30bp以上的長雙鏈RNA（dsRNA），往往會誘發(fā)非預期的抗病毒應答

4、反應，所以不能用體外合成的dsRNA直接導入細胞，常見的做法之一是直接制備1927bp左右的siRNA，然后再將siRNA轉入哺乳動物細胞。siRNA的轉染 哺乳動物轉染的常見方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、機械法（例如,顯微注射和基因槍）、陽離子脂質體試劑，其中陽離子脂質體試劑轉染法是目前最常用的轉染方法。siRNA的轉染 有些研究人員發(fā)現(xiàn)，攜帶siRNA的脂蛋白納米顆粒通過內吞作用進入細胞，一旦納米顆粒進入細胞，就會被捕獲在小泡中，這阻礙了大部分siRNA接近位于細胞質的目標mRNA。甚至會在一小時內將其分解并排出細胞。siRNA的轉染 研究顯示，在納米顆粒的再利用過程中，蛋白NPC1 是

5、一個主要因子。沒有這一蛋白，納米顆粒就不會被細胞排出，讓siRNA有更多的時間去結合目標mRNA。NPC1缺乏時會出現(xiàn)交通擁堵，這樣siRNA就有更多的時間逃逸出來，但也會影響細胞的其他生理活動，所以現(xiàn)在大部分研究人員都在通過改進脂蛋白納米顆粒的結構，來增強siRNA的轉染效率。線路三：shRNA 表達載體和病毒載體 這類載體都包含有一個RNA聚合酶 啟動子和一個45個連續(xù)的T構成的轉錄終止位點以及選擇標記，選用Pol 啟動子是因為此啟動子總是在距其一定距離的位置起始轉錄，而遇到45個連續(xù)的T就終止轉錄，并且終止于轉錄終止位點第二個堿基處，十分精確。 此法需首先化學合成一段編碼siRNA 正義

6、和反義鏈的模板，正義與反義序列之間由一段環(huán)(1oop)序列隔開。插入載體Pol 啟動子下游，然后轉入細胞，環(huán)序列可使轉錄出的RNA鏈折疊成具發(fā)夾結構的小RNA分子（shRNA） ，這些小RNA可被細胞內的Dicer切割為長21bp的siRNA。 RNAi作為一種重要的基因轉錄后沉默機制，廣泛應用于基因功能研究，腫瘤及病毒感染性疾病治療的實驗研究，其核心內容是siRNA能夠抑制同源基因的表達。對于siRNA 而言，現(xiàn)在頗有爭議的地方在于它對靶基因的沉默特異性，主要體現(xiàn)在兩個方面：（1）脫靶效應。（2）打破內源性miRNA的平衡。RNAi機制的缺陷脫靶效應 即siRNA 對靶基因的沉默并不一定嚴格按照序列特異性方式進行。（1）對于21-23nt 的siRNA，只需少至7nt 的序列與mRNA 同源，均可導致該基因的沉默。（2）誘導機體或細胞產生天然或獲得性免疫應答，被一些蛋白酶降解，從而降低siRNA 對靶基因的特異性。降低siRNA 脫靶效應（1）要減少脫靶效應，可以將針對同一mRNA的不同siRNA混合起來使用。這些siRNA作用于同一個目標，每種siRNA的濃度得以降低，稀釋了各自的脫靶效應，但不損害靶的特異性敲除。（2）對siRNA的化學修飾siRNA的化學修飾主要有三類：磷酸骨架修飾