小鼠肝組織RNA提取及RT-PCR實(shí)驗(yàn)_第1頁
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文檔簡介

1、小鼠肝組織小鼠肝組織RNA提取及提取及RT-PCR一、試劑及材料一、試劑及材料1、小鼠肝臟、小鼠肝臟2、DEPC處理過的處理過的EP管、管、PCR管管3、 Trizol 、氯仿、異丙醇、氯仿、異丙醇、DEPC水水二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 TRIZOL：異硫氰酸胍：異硫氰酸胍 + 苯酚苯酚 裂解細(xì)胞，RNA與蛋白質(zhì)分離，將RNA釋放到溶液中。促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層。RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。分離開。水相層（無色）主要為水相層（無色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主，有機(jī)層（黃色）主要為要為DNA和蛋白質(zhì)。和蛋白質(zhì)。三、實(shí)驗(yàn)步驟三

2、、實(shí)驗(yàn)步驟 RNA提取提取1、新鮮肝組織置、新鮮肝組織置EP管中，加管中，加200 l Trizol充分研磨后，補(bǔ)加充分研磨后，補(bǔ)加800 l Trizol，槍頭吹勻。，槍頭吹勻。2、加入、加入200 l 氯仿，劇烈震蕩氯仿，劇烈震蕩15秒，秒，4 12000g離心離心15min。3、將上層水相移至潔凈、將上層水相移至潔凈EP管中，加入管中，加入500 l異丙醇顛倒混勻。異丙醇顛倒混勻。4、4 12000g離心離心10min。5、棄水相，、棄水相，EP管開蓋干燥，溶于管開蓋干燥，溶于50 l DEPC水中。水中。 RT-PCR：RNA的反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄 + cDNA的的PCRRT-PCR操作步驟

3、操作步驟 5x Prime Script Buffer 2 l Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 l Oligo dT primer (50 m) 0.5 l Random 6 mers (100 m) 1 l 提取的提取的RNA 0.5 l RNase Free 水水 5.5 l 37 15min 85 5 sec10 l精選課件7PCR10 x PCR Buffer 5 l dNTP 4 l 模板模板DNA 2 l引物引物1 2 l 引物引物2 2 lTaq 酶酶0.5 l H2O 34.5 l 50 l 94 5 min 94 30 sec 54 30 sec 72

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