曲克蘆丁與牛血清白蛋白相互作用的光譜研究

1、曲克蘆丁與牛血清白蛋白相互作用的光譜研究 11-03-24 09:34:00 編輯：studa20 作者：孫榮梅， 于麗燕， 陳昌云【摘要】 目的： 應(yīng)用光譜技術(shù)研究曲克蘆丁(troxerutin, TRO)與牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 間結(jié)合作用機(jī)制。方法： 通過熒光光譜法確定曲克蘆丁對BSA的熒光猝滅機(jī)制。依據(jù)熱力學(xué)參數(shù)討論兩者之間的主要作用力類型。利用同步熒光光譜考察曲克蘆丁對BSA構(gòu)象的影響。結(jié)果： 曲克蘆丁對BSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅;反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)H=-77.06 KJ/mol，S=-152.20 J/(molK)。結(jié)論： 曲克蘆丁與BS

2、A之間的主要作用力是范德華力;曲克蘆丁的加入使BSA構(gòu)象發(fā)生了變化。 【關(guān)鍵詞】 牛血清白蛋白; 曲克蘆丁; 熒光猝滅; 同步熒光光譜Abstract Objective: Applied spectroscopy to study the interaction mechanism of troxerutin and bovine serum albumin(BSA).Methods： Fluorescence spectroscopy method was used to determine the fluorescence quenching mechanism of BSA cause

3、d by troxerutin.According to the thermodynamic parameters the major force types between troxerutin and BSA was discussd.The effect of troxerutin on bovine serum albumin was also studied by synchronous fluorescence spectrometry.Results： The quenching mechanism of troxerutin to bovine serum albumin wa

4、s static quenching.The thermodynamic parameters of the reaction was H=-77.06 KJ/mol，S=-152.20 J/(molK).Conclusion： The main binding force between troxerutin and BSA was Van derWaals interaction.Troxerutin binding on the bovine serum albumin could change the serum protein conformation.Key words bovin

5、e serum albumin; troxerutin; fluorescence quenching;synchronous fluorescence spectroscopy曲克蘆丁(troxerutin,TRO)系蘆丁經(jīng)羥乙基化制成的半成品黃酮化合物。具有抑制紅細(xì)胞和血小板凝結(jié)，防止血栓形成的作用;同時能增加血中氧的含量，改善微循環(huán)，促進(jìn)新生血管形成以增進(jìn)側(cè)支循環(huán)的開放1。結(jié)構(gòu)見圖1。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，它能和許多內(nèi)源性物質(zhì)廣泛結(jié)合。各種藥物進(jìn)入人體一般都要通過血漿的貯存和運輸，而后才能到達(dá)受體部位并發(fā)生藥理作用。研究藥物與血清白蛋白的相互作用具有重要的理論意義2。蛋

6、白質(zhì)的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，研究中藥有效成分對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，不僅能為確定中草藥有效成分及作用強(qiáng)度提供一定信息，而且對全面闡明小分子化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)制也有重要意義，同時也有利于了解中藥的作用機(jī)制。本文研究了TRO與牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的作用機(jī)制以及溫度對結(jié)合常數(shù)的影響。分析了TRO與BSA的結(jié)合模式，從分子水平認(rèn)識該反應(yīng)的作用機(jī)制。圖1 曲克蘆丁的結(jié)構(gòu)Fig 1 The structure of troxerutin1 材料與方法1.1 儀器和試劑TU1901PC型分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，LS50B型熒光分光光度計(美國Per

7、kinElmer公司)，PHS25型PH計(上海雷磁儀器廠);TRO(中國藥品生物制品檢定所),牛血清白蛋白(Sigma公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、氯化鈉等試劑均為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。1.2 溶液配制用0.9%NaCl配成pH=7.4的TrisHCl緩沖液來配制濃度為1.010-3 mol/L的TRO儲備液備用;以TrisHCl緩沖溶液(pH=7.4，含0.1 mol/L NaCl 以維持溶液的離子強(qiáng)度)為溶劑配制1.010-4 mol/L 的BSA儲備液備用。1.3 實驗方法熒光光譜的測定：取3 ml 1.010-6 mol/L的BSA溶液于1 cm的石英比色皿中，

8、用微量注射器逐次加入濃度為1.62610-3 mol/L的TRO溶液進(jìn)行滴定，加樣體積由實驗點濃度計算確定(滴定劑累加體積小于100 l)。以278 nm為激發(fā)波長，繪制300500 nm波長范圍的熒光光譜;同步熒光光譜實驗中同時掃描激發(fā)和發(fā)射單色器，固定激發(fā)和發(fā)射波長差分別為60 nm和20 nm，其他同熒光光譜測量。紫外吸收光譜的測定：移取10 ml 110-4 mol/ L 的曲克蘆丁溶液于10 ml比色管中,加入pH=7.4 的TrisHCl緩沖溶液定容至刻度,以TrisHCl 緩沖溶液做參比,測定紫外吸收光譜。2 結(jié) 果2.1 紫外光譜的研究由BSA,TRO及TROBSA(11)復(fù)合

9、體系的紫外吸收光譜(圖2)可以看出，TROBSA復(fù)合體系的吸收光譜與單獨TRO,BSA的吸收光譜相比，發(fā)生了明顯的減色效應(yīng)。吸收光譜的變化表明TRO和BSA之間的相互作用是在基態(tài)分子中發(fā)生的。2.2 TRO對BSA的熒光猝滅研究蛋白質(zhì)能夠發(fā)出熒光是因為蛋白質(zhì)中存在三種芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。由于這些氨基酸結(jié)構(gòu)不同，其熒光強(qiáng)度之比為10090.5，因此大多數(shù)情況下可以認(rèn)為蛋白質(zhì)所顯示的熒光主要由色氨酸殘基貢獻(xiàn)3。而當(dāng)激發(fā)波長為278 nm時，TRO在300500 nm范圍內(nèi)幾乎無熒光。固定BSA的量，不斷增加TRO濃度時，BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，不同溫度時的熒光猝滅曲線如

10、圖3,4所示。C(BSA)=1.010-6 mol/L;=278 nm;pH=7.4;C(TRO)(AF)：0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.510-6 mol/L圖3 25時TRO對BSA的熒光猝滅光譜Fig 3 Effect of TRO on fluorescence spectrumof BSA at 25C(BSA)=1.010-6 mol/L;=278 nm;pH=7.4;C(TRO)(AF)：0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.510-6 mol/L圖4 37時TRO對BSA的熒光猝滅光譜Fig 4 Effect of TRO on fluorescence spectrumof BSA at 37熒光猝滅通?？煞譃閯討B(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。一般情況下，可依