酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)慶大霉素和順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

1、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)慶大霉素和順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（973項(xiàng)目）（G199954204）作者簡(jiǎn)介：劉華鋼（1956-），女，博士生導(dǎo)師，教授，主要研究方向：中藥新劑型、新制劑及藥理作用機(jī)制通訊作者：劉華鋼，電話E-mail: hgliu。 （收稿日期：2007-07-18 接受日期：2007-08-12）劉華鋼1 黃巨恩2 劉麗敏1 王慧杰2 胡文娟2 李校堃3 肖健3（1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣西南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；3溫州醫(yī)學(xué)院生物與天然藥物研究院浙江溫州 325027）摘要

2、：目的 研究酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)對(duì)慶大霉素（GM）和順鉑(DDP)引起的體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞損害的保護(hù)作用。方法 大鼠腎皮質(zhì)經(jīng)研磨、過網(wǎng)、胰蛋白酶消化，進(jìn)行腎小管上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)。經(jīng)Cytokeratin 18抗體進(jìn)行鑒定后，用GM、DDP建立損傷模型，觀察aFGF對(duì)損傷的腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果 經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、GM或DDP組與對(duì)照組比較，CAT、SOD、GSH-Px、NaKATP酶活性下降，而NAG活性和NO、MDA升高（(P<0.01或P<0.05)，提示腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和GM、DDP損傷的建模成功。aFGF+GM或DDP組與GM組或DDP組比較，大

3、多數(shù)生化和酶學(xué)指標(biāo)有顯著或非常顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；而aFGF+GM或DDP組與對(duì)照組比較，CAT、NAG、GSH-Px 、NaKATP酶活性無(wú)顯著性差異，但SOD活性下降、NO、MDA升高尚有顯著性差異 (P<0.05)。結(jié)論 aFGF對(duì)GM、DDP損傷的腎小管上皮細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；順鉑；腎小管上皮細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；中圖分類號(hào)：R-332 R322.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：16673-6273（2008）Protective Effects of afgf on Renal Tubular Epithelial

4、Cells Injured by Gentamicin and Cisplatin in Vitro*LIU Hua-gang1, HUANG Ju-en2,LIU Li-min1,WANG Hui-jie2,HU Wen-juan2, LI Xiao-kun3,XIAO Jian3(1 Pharmacy college of Guang Xi Medical University, 530021, Nanning, China ; 2 Dept. of Histology and Embryology, Guang Xi Medical University, 530021, Nanning

5、, China; 3 Institute of Biology and Nature Medicine,Wenzhou Medical Coleg,325027,Wenzhou China)ABSTRACT: Objective To investigate the protective effects of aFGF on the cultured renal tubular epithelial cells injured by Gm and DDP. Methods Renal tubular epithelial cells of SD rats were cultured after

6、 its renal cortices were grounded, filtered and digested with 0.25%trypsin. The cell types of epithelial cells were identified by Cytokeratin 18 immunocytochemistry. The injuried model of renal tubular epithelial cells were established by treating with Gentamicin or Cisplatin and the protective effe

7、cts of aFGF on injured renal tubular epithelial cells were observed. Results By observing the morphology of the renal epithelial cells and comparing GM and DDP group with control group, the activities of CAT, SOD, GSH-Px and Na+-K+-ATP enzyme decreased, while NAG activity and NOMDA level increased (

8、P<0.01 or P<0.05). These results indicated the success of the culture of renal tubular epithelial cells and foundation of the model injured by GM and DDP. Comparing aFGF+GM or DDP group with GM or DDP group, most indices of biochemistry and enzymology of the culture contents had significant or

9、 high significant differences (P<0.05 or P<0.01); however, the differences of the CAT, NAG, GSH-Px and Na+-K+-ATP enzyme activities between the aFGF+GM, DDP group and control group were non-significant, while SOD activity and NOMDA were still significant(P<0.05). Conclusion aFGF had protect

10、ive effects on renal tubular epithelial cells injured by GM and DDP.Key words: aFGF; cisplatin; Renal tubular epithelial cell; Cell cultureChinese Library Classification:R-332, R322.61 Document code : A Article ID: 16673-6273(2008)前言以慶大霉素(Gentamicin, GM)為代表的氨基糖甙類抗生素主要作用于革蘭氏陰性細(xì)菌，因其抗菌譜廣、療效價(jià)且費(fèi)用低廉而

11、廣泛應(yīng)用于臨床，但由于血清有效濃度與毒性濃度相近，毒性作用的發(fā)生率高；而順式二氯二氨鉑或簡(jiǎn)稱順鉑(Cisplatin, DDP或CDDP)是一種廣譜、有效的抗癌藥物，其療效與用藥劑量成正比。盡管GM 和DDP在分子結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理和臨床適應(yīng)癥等方面都存在很大的差異，但在副作用方面卻很相似，即過量使用都會(huì)引起嚴(yán)重的腎毒性和耳毒性，這也是它們臨床應(yīng)用受限的主要原因1-2。本研究用原代培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞制作GM、DDP腎損傷模型，觀察aFGF的作用，并探討其可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 實(shí)驗(yàn)使用SD大鼠40只，體重約50 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供

12、。新生小牛血清由杭州四季青公司提供；DMEM培養(yǎng)基由Gibco公司提供；胰蛋白酶由Sigma公司提供；抗細(xì)胞角質(zhì)素(Cytokeratin 18)抗體、SABC、DAB試劑盒由武漢博士德公司提供；硫酸慶大霉素由廣西南寧市百合藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品（批號(hào)0504004）；DDP為江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品（批號(hào)051003）；基因重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rh-aFGF)由暨南大學(xué)生物工程研究所提供（批號(hào)20050618）；丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、過氧化氫酶測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH - Px)試劑盒、N-乙酰氨基-D葡萄糖苷酶(NAG)測(cè)定試劑盒、

13、ATP酶測(cè)定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。1. 2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟1.2.1 腎小管節(jié)段的分離、消化 斷頭處死大鼠，無(wú)菌條件下取腎，將腎皮質(zhì)分離后洗凈剪碎，用PBS平衡鹽溶液清洗幾次。將洗凈的腎皮質(zhì)剪成12 mm 大小的組織塊，用0.25 %胰蛋白酶37消化10 min，消化后的細(xì)胞懸液800 r·min- 1離心5 min。棄上清液，將沉淀再消化20 min。顯微鏡下觀察直至腎小管節(jié)段變成松散、粘稠狀，并且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。其懸液?00目的尼龍細(xì)篩過濾, 濾去較大的組織塊。濾液1000 r·min- 1離心5min，棄上清液。將沉淀重懸于DMEM培養(yǎng)液中，800

14、 r·min- 1離心 5 min，洗滌3 次，所得沉淀即為分離的腎小管上皮細(xì)胞。1.2.2 腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 加入5 ml含有10%新生小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，充分吹打直到腎小管節(jié)段分散為細(xì)胞懸液為止。調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24后首次換液，倒置相差顯微鏡觀察，圍繞腎小管節(jié)段有卵圓型上皮樣細(xì)胞長(zhǎng)出，呈島嶼狀向四周逐漸擴(kuò)增，細(xì)胞形態(tài)呈鵝卵石樣。以后視細(xì)胞生長(zhǎng)情況于48或72h后再次換液。細(xì)胞于72至120h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，可用于實(shí)驗(yàn)。1.2.3 腎小管上皮細(xì)胞的鑒定 采用Cytokeratin

15、 18免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定，一抗為1：400 Cytokeratin l 8抗體，二抗為1:100的山羊抗小鼠。陰性對(duì)照則用PBS代替一抗，其余步驟相同。1.2.4 aFGF對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用 實(shí)驗(yàn)分3組（GM實(shí)驗(yàn) n=6，DDP實(shí)驗(yàn) n=10）： 對(duì)照組(未加處理因素)：即在含10 %新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細(xì)胞；損傷組(GM或DDP組):即在含0.8 mmol.L-1 GM或12.5 g.L-1 DDP和10 %新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細(xì)胞； 細(xì)胞因子組(aFGF+GM或DDP組):即在加入GM或DDP的10 %新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h后再

16、加aFGF4.5 g.L-1（GM實(shí)驗(yàn)）或0.45 g.L-1（DDP實(shí)驗(yàn)）培養(yǎng)的細(xì)胞。以上各組均取原代培養(yǎng)3 d的細(xì)胞。給藥48 h（DDP實(shí)驗(yàn)）或72 h（GM實(shí)驗(yàn)）后檢測(cè)細(xì)胞的酶和生化指標(biāo)： MDA含量測(cè)定采用TBA法； NO的測(cè)定采用硝酸還原酶法； SOD活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法；NAG活性測(cè)定采用對(duì)硝基酚比色法；Na-K-ATP酶活性是在660 nm處測(cè)定OD值；GSH-Px活性是在412 nm處測(cè)定OD值。以上各項(xiàng)檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒操作。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各分組所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，用SPSS10.0軟件處理數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。

17、檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05， p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果 2.1 原代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)觀察正常培養(yǎng)（對(duì)照組）96-120h的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)為多邊鵝卵石樣，獨(dú)立生長(zhǎng)或以組織塊為中心分裂增殖生長(zhǎng)，鏡下透明度及折光性強(qiáng)（圖1）；加入GM12h或DDP48h后均可見細(xì)胞明顯腫脹、邊界消失，出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞融合成團(tuán)塊狀的現(xiàn)象，培養(yǎng)液中多見細(xì)胞碎片（圖2、圖3）；其中加入DDP作用12 h后再加aFGF培養(yǎng)48 h，可見細(xì)胞腫脹程度減輕，輪廓清晰，細(xì)胞融合成團(tuán)不明顯（圖4）。圖 1 培養(yǎng)4 d生長(zhǎng)良好的腎小管上皮細(xì)胞 (200×) Fig. 1 Renal tubular epithelial c

18、ell cultivated for four days (200×)2.2 腎小管上皮細(xì)胞的鑒定Cytokerafin 18免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)顯色34 min，光鏡下可見陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核中空而胞漿染色的細(xì)胞形態(tài)，胞漿內(nèi)可見不均勻、散在分布、強(qiáng)度不一的棕褐色顆粒狀或點(diǎn)狀染色(圖5)，并與陰性細(xì)胞間雜分布。圖5腎小管上皮細(xì)胞Cytokeratin18免疫細(xì)胞化學(xué)染色 (200×)Fig. 5 Renal tubular epithelial cell stained by Cytokeratin18 immunocytochemicamisty (200×)為了解C

19、ytokeratin 18 陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況，我們對(duì)Cytokeratin 18免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)的10張細(xì)胞培養(yǎng)染色標(biāo)本，每張各取5個(gè)視野在100×光鏡下，用方格微尺進(jìn)行陽(yáng)性和陰性細(xì)胞記數(shù)，結(jié)果表明：Cytokeratin 18陽(yáng)性細(xì)胞約占94.2。2.3 給藥72h或48h后，腎小管上皮細(xì)胞的酶學(xué)和生化指標(biāo)的檢測(cè)給藥72h（GM實(shí)驗(yàn)）或48 h（DDP實(shí)驗(yàn)）后，各組腎小管上皮細(xì)胞的酶學(xué)和生化指標(biāo)的檢測(cè)分別（表1、表2）。結(jié)果表明：GM的毒性作用可使培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞SOD，CAT，Na+-K+-ATP酶活性下降，MDA、NAG水平升高，DDP的毒性作用可使培養(yǎng)的腎小管

20、上皮細(xì)胞SOD、GSH-Px酶活性下降，MDA、NO水平升高，而aFGF則表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用。表1 給GM 72h后CAT、SOD、NAG、Na-K-ATP酶活性以及MDA變化(±s)Table 1 CAT, SOD, NAG, Na-K-ATP enzyme activity and MDA changes after treated with GM for72h Group CAT(U/g) NAG(U/g) SOD Na-K-ATP enzyme MDA (U . mg-1. prot-1) (molpi.mg-1.pr-1.10min-1) (nmol.mg-1. pr-1

21、)Control group 144.11±2.12 76.65±1.24 79.12±3.56 40.06±0.98 7.49±1.23(aFGF + GM) group 143.45.32±2.15 74.89±1.57 78.23±1.56 # 41.12±0.88 8.10±0.08 #Note : P0.05 GM group compared with control group；P0.05 (aFGF + GM) group compared with GM group；#P0.0

22、5 (aFGF+DDP) group compared with control group.表2 給DDP 48h后SOD、GSH-Px酶活性以及NO、MDA變化(±s)Table 2 SOD, GSH-Px enzyme activity and MDA, NO changes after treated with DDP for 48hGroup SOD GSH-Px MDA NO（U.ml-1） （U.ml-1） (t-1) （t-1） Control group 76.71±5.84 51.32±3.83

23、7.23±1.42 0.11±0.04DDP group 42.61±6.79 24.67±2.87 12.81±2.46 0.29±0.11 (aFGF+DDP) group 69.52±10.53 46.88±5.79 10.17±1.85# 0.19±0.07#Note : P0.05 DDP group compared with control group；P0.05 (aFGF + DDP) group compared with DDP group；#P0.05 (aFGF+DDP

24、) group compared with control group.3 討論目前的研究表明：氨基糖甙類抗生素是通過一種稱為GP330(glycoprotein 330) 的膜蛋白受體介導(dǎo)的陽(yáng)離子蛋白或受體內(nèi)吞飲作用而進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞(尤其是近端小管上皮細(xì)胞)，形成的囊泡與初級(jí)溶酶體結(jié)合為次級(jí)溶酶體，使溶酶體膜通透性增加，溶酶體酶大量漏出，繼而損害線粒體等細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死3-4。而DDP腎毒性的病理機(jī)制有兩種5：一是DDP可引起腎血管收縮，使腎血流量及腎小球?yàn)V過率下降，從而引起蛋白尿、腎功能損傷等癥狀；二是DDP可引起近端腎小管上皮細(xì)胞缺血、缺氧，甚至壞死，其早期往往首先損害

25、腎近曲小管，尤其是近曲小管直段細(xì)胞，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂，表現(xiàn)為腎小管重吸收功能與尿濃縮稀釋能力降低，尿鈉排出增多及對(duì)ADH的反應(yīng)異常等。從細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制上來看，與氧化應(yīng)激有關(guān)的氧化性損傷可能是DDP引起腎功能損害的主要原因。酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)是一種促有絲分裂的小蛋白質(zhì)分子，等電點(diǎn)57，分子量16.5KD，大約由154個(gè)氨基酸組成。aFGF具有兩大類型的活性：其一，促有絲分裂活性，可促進(jìn)組織細(xì)胞分裂、增殖；其二，非促有絲分裂活性，包括舒張血管、神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)和局部缺血保護(hù)等6-7。我們?cè)谇捌谘芯恐?，已觀察到aFGF對(duì)腎缺血-再灌注損傷有良好的拮抗效應(yīng)8 ，并且在體外

26、培養(yǎng)條件下可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞存活與增殖，但aFGF是否對(duì)GM和DDP誘導(dǎo)的分離培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，以及機(jī)制如何，尚不清楚。本研究結(jié)果表明：aFGF明顯拮抗GM對(duì)腎小管上皮細(xì)胞毒性損傷后所造成的酶活性和生化指標(biāo)的改變。其中，aFGF+GM組的CAT、NAG、Na-K-ATP酶活性三項(xiàng)指標(biāo)都與未施加任何影響因素的對(duì)照組處于同一水平；SOD活性下降和MDA水平升高雖然與對(duì)照組仍有顯著性差異(P<0.05)，但卻明顯優(yōu)于GM組。而aFGF也明顯拮抗DDP對(duì)腎小管上皮細(xì)胞毒性損傷后所造成的細(xì)胞腫脹、SOD、GSH-Px酶活性下降和MDA、NO水平升高。其中，aFGF+DDP組的

27、GSH-Px、SOD兩項(xiàng)指標(biāo)也與未施加任何影響因素的對(duì)照組處于同一水平；MDA、NO水平雖然比對(duì)照組水平偏高，但卻仍然明顯低于DDP組。這些結(jié)果與我們所用bFGF拮抗GM對(duì)體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞的毒性作用的實(shí)驗(yàn)研究9頗相似，使我們有理由相信：aFGF、bFGF對(duì)GM和DDP導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞毒性損傷的保護(hù)作用機(jī)理，直接或間接與拮抗自由基的產(chǎn)生、加強(qiáng)其清除和保護(hù)抗氧化酶活性有關(guān)。從傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的理論來看，腎虛往往會(huì)導(dǎo)致頭昏、眼花、耳鳴；而從西醫(yī)學(xué)的角度，盡管GM和DDP在分子結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理和臨床適應(yīng)癥等有很大差異，但在副作用方面卻很相似，即過量使用都會(huì)引起嚴(yán)重的腎毒性和耳毒性，而且往往腎毒性在先

28、，耳毒性在后，中西醫(yī)理論在此似乎得到奇妙的交融。我們的理解是：人類的腎臟組織與內(nèi)耳組織可能均對(duì)某些化學(xué)物質(zhì)存在相同或相似的特異性受體，只是在量、敏感度以及代謝過程等方面的不同使得損傷情況有所差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DDP腎毒性并非僅僅使腎血管收縮導(dǎo)致缺血性腎損傷，而且可能還同時(shí)存在一種直接的毒性作用。參考文獻(xiàn)(References)1 Huang Ju-en, Xu Zhi-wen, Chen Yu, et al. Progress in the study on toxic effect, prevention and cure of gentamycinJ. Medical Recapitul

29、ate, 2002, 8(9):555-5572 Robson H, Meyer S, Shalet SM, et al. Platinum agents in the treatment of osteosarcoma: efficacy of cisplatin vs. carboplatin in human osteosarcoma cell lines J.Med Pediatr Oncol , 2002, 39: 573-5803 He Ya-ni, Liao Li-shen, Jiang Jian-xin. Study of gentamicin-induced mitochondrial and lysosomal damages in renal cortex in ratsJ Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae, 1996, 18(3): 243-2454 Decorti G,Malusa N, Furlan G, et al. Endocytosis Of gentamicin in a proximal tubular renal cell lineJ.Life sci, 1999, 65(11):1115-11185 Zhou Dong, Sun Wei. Progress in the study on