研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用

1、一、凝膠阻滯試驗(yàn)1.試驗(yàn)原理又叫作DNA遷移率變動試驗(yàn)（DNA mobility shift assay），在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。2.主要步驟及內(nèi)容首先是用放射性同位素標(biāo)記待檢測的DNA片段(亦稱探針DNA)，然后同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一道溫育，于是便有可能形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。將它加樣到非變性的聚丙烯酰胺凝膠中，在控制使蛋白質(zhì)仍與DNA保持結(jié)合狀態(tài)的條件下進(jìn)行電泳分離。應(yīng)用放射自顯影技術(shù)顯

2、現(xiàn)具放射性標(biāo)記的DNA條帶位置。如果細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物中不存在可同放射性標(biāo)記的探針DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，那么所有放射性標(biāo)記都將集中出現(xiàn)在凝膠的底部，反之，將會形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于凝膠阻滯的緣故，其特有的放射性標(biāo)記的探針DNA條帶就將滯后出現(xiàn)在較靠近凝膠頂部的位置。凝膠阻滯試驗(yàn)不僅可以用來鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否存在著能夠同某一特定DNA片段結(jié)合的蛋白質(zhì)分子(比如特異的轉(zhuǎn)錄因子等)，而且還可以用來研究發(fā)生此種結(jié)合作用之精確的DNA序列的特異性。其辦法是在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)體系中，加入超量的非標(biāo)記的競爭DNA(competitor DNA)。 如果它與同位素標(biāo)記的探針DNA結(jié)合

3、的是同一種蛋白質(zhì)，那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分蛋白質(zhì)都會被其競爭結(jié)合掉而使探針DNA仍處于自由的狀態(tài)，所以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現(xiàn)阻滯的條帶。相反地，如果反應(yīng)中加入的競爭DNA并不能夠同探針DNA競爭結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，于是探針DNA便仍然與特定蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，結(jié)果在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就會呈現(xiàn)阻滯的條帶。在凝膠阻滯試驗(yàn)中使用競爭DNA，可以間接地闡明在體內(nèi)發(fā)生的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。例如，使用一種具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的競爭DNA，我們就可以判斷通過特定的凝膠阻滯試驗(yàn)所檢測到的蛋白質(zhì)，是否就是屬于此類轉(zhuǎn)錄因子，抑或是與之相關(guān)的

4、其它因子。同樣地，假如我們在競爭DNA上已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)處，事先引入一個或少數(shù)幾個堿基突變，通過凝膠阻滯試驗(yàn)亦可有效地評估出這些突變對競爭DNA的性能及其與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作用的影響。二、DNaseI足跡試驗(yàn)(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足跡試驗(yàn)是一種測定DNA結(jié)合蛋白在DNA上的準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)的技術(shù)。首先是對包含一定順式作用元件的雙鏈DNA進(jìn)行單鏈標(biāo)記，然后用DNaseI水解單鏈標(biāo)記的雙鏈DNA，產(chǎn)生不同長度的片斷，DNA結(jié)合蛋白與其特異序列結(jié)合處由于空間位阻，DNaseI對這部分DNA不能切割，即被DNaseI保護(hù)。DNaseI水解產(chǎn)物經(jīng)尿素變性，P

5、AGE分離及放射性顯影后，形成以相差一個核苷酸為梯度的一系列DNA條帶，在此顯影圖中相應(yīng)于DNA結(jié)合蛋白的位置上由于DNA結(jié)合蛋白的保護(hù)作用而形成了空白區(qū)域。如果在電泳時結(jié)合DNA化學(xué)測序，則可準(zhǔn)確判斷出結(jié)合區(qū)的精確序列。三、甲基化干擾試驗(yàn)根據(jù)DMS能使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理而設(shè)計(jì)。具體操作是，先用DMS處理DNA，并控制反應(yīng)條件，使之達(dá)到平均每條DNA分子只有一個殘基被甲基化；而后將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結(jié)合蛋白的適當(dāng)細(xì)胞提取物一道溫育，并做凝膠阻滯試驗(yàn)。經(jīng)電泳分離后，從凝膠中切除具有結(jié)合蛋白的DNA條帶和沒有結(jié)合蛋白的DNA條帶，并用六

6、氫吡啶處理之。于是，甲基化的殘基被切割，不具甲基化的殘基不被切割。顯而易見，如果因一個G殘基的甲基化作用阻止了蛋白質(zhì)同DNA的結(jié)合，那么六氫吡啶對這個甲基化G殘基的切割作用，就只能在沒有同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA分子中觀察到。相反地，如果一個特殊的G殘基在DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合中不起作用，那么六氫吡啶對這個G殘基的切割作用，則在同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA分子中及不同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA分子中均可觀察到。四、 酵母單雜交技術(shù) 酵母單雜技術(shù)是1993 年由Li et al 從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來的其基本原理為: 真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與。轉(zhuǎn)錄因子通常由一個DNA 特異性結(jié)合功能域和一個或多個其他調(diào)控

7、蛋白相互作用的激活功能域組成即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain AD). 用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的錄因子。GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)， 而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID 相互作用提高RNA 聚合酶的活性。在這一過程中DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此我們可將GAL4 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達(dá)的蛋白能與目的基因相互作用同樣可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活R

8、NA聚合酶啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。 其基本操作過程為:(1)設(shè)計(jì)含目的基因(稱為誘餌)和下游報告基因的質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入酵母中；(2)將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入同一酵母中；(3)若文庫蛋白與目的基因相互作用可通過報告基因的表達(dá)將文庫蛋白的編碼基因篩選出來. 在這里作為誘餌的目的基因就是啟動子DNA 片段，文庫基因所編碼的蛋白就是啟動子基因結(jié)合蛋白. 酵母單雜交技術(shù)廣泛用DNA與蛋白相互作用的研究。五、噬菌體展示技術(shù) 噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達(dá)產(chǎn)物和親選擇相結(jié)合的技術(shù)。基本原理及操作過程為：以改構(gòu)的噬菌體為載體把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白基

9、因區(qū)，如在噬菌pIII 和p VIII 衣殼蛋白基因區(qū)的N 端插入外源基因，形成的融合蛋白，表達(dá)在噬菌的表面不影響噬菌體的生活周期及天然構(gòu)型，且易被相應(yīng)的抗體或受體分子識別。外源蛋白或多肽表達(dá)于噬菌體的表面與固定或固相支持物結(jié)合通過適當(dāng)?shù)奶韵?，洗去非特異性結(jié)合的噬菌體(即親和富集法)選出目的噬菌體而編碼基因作為病毒基因組的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA 測序得知. 在這一過程中外源基因是編碼啟動子DNA 結(jié)合蛋白的文庫基因而固定或固相支持物分子則為啟動子DNA片段. 噬菌體展示技術(shù)是一種經(jīng)濟(jì)高效的研究生物大分子相互作用的技術(shù)如構(gòu)建噬菌體隨機(jī)多肽文庫可用來篩選包括抗體小分子細(xì)胞表面受體等多

10、種分子。Cicchini et al 用噬菌體展示技術(shù)篩選出肝富有的轉(zhuǎn)錄因子HNF1a 啟動子結(jié)合蛋白.與蛋白相互作用的研究。六、核酸適體技術(shù)核酸適體(aptamer)指的是經(jīng)過一種新的體外篩選技術(shù)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evo lution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，從隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸文庫中得到的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸，可以是RNA 也可以是DNA，長度一般為2560 個核苷酸。SELEX的篩選流程首先是利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)人工合成一個含有10141015 個單鏈寡核苷酸序列的隨

11、機(jī)文庫，序列長度往往在2535 個核苷酸之間，單鏈的隨機(jī)寡核苷酸序列容易形成可與蛋白質(zhì)等配體特異性共價結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)，在這一高親和力特異性結(jié)合的基礎(chǔ)之上配體蛋白質(zhì)同隨機(jī)文庫相互作用，選擇性分離出核酸適體后，然后通過PCR或RT-PCR 等技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。次一級文庫再與配體蛋白質(zhì)相互作用，反復(fù)多次循環(huán)，即可獲得與配體蛋白質(zhì)特異性高親和力結(jié)合的核酸適體。核酸適體與配體間的親合力(解離常數(shù)在皮摩和納摩之間)常要強(qiáng)于抗原抗體之間的親合力。核酸適體所結(jié)合的靶分子范圍非常廣泛，除蛋白質(zhì)之外，還能作用于酶、生長因子、抗體、基因調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞黏附分子、植物凝集素、完整的病毒顆粒、病原菌等。適體從20 世紀(jì)90

12、年代初出現(xiàn)以后，就得到了科研工作者的廣泛關(guān)注，適體的研究工作得到了快速的發(fā)展。SELEX篩選技術(shù)和核酸適體的高親和性在蛋白質(zhì)/ 核酸相互作用的研究中發(fā)揮了重要的作用。七、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)：體內(nèi)足跡試驗(yàn)原理與甲基化試驗(yàn)基本相同，其實(shí)質(zhì)是體外甲基化試驗(yàn)的變種。在體內(nèi)足跡試驗(yàn)中，是用有限數(shù)量的DNS處理完整的游離細(xì)胞，并使其滲透到細(xì)胞內(nèi)的濃度恰好導(dǎo)致天然染色體DNA中G殘基發(fā)生甲基化。而后從這些細(xì)胞中提取DNA，并加入六氫吡啶作體外消化。結(jié)果情況就如同體外足跡試驗(yàn)一樣，能與某中特殊蛋白質(zhì)因子結(jié)合的DNA區(qū)段，其上的G殘疾就不會被DNS甲基化，因而就不會被六氫吡啶所切割。因此，同對照的體外裸露DNA所形成

13、的序列梯度比較，就會發(fā)現(xiàn)由完整的活細(xì)胞染色質(zhì)DNA形成的序列梯度中，缺少了G殘基沒有被切割的相應(yīng)條帶。經(jīng)體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)從染色體總DNA中獲得的任何一種特異DNA的數(shù)量都是很少的。因此，有必要通過PCR技術(shù)從染色質(zhì)總DNA中擴(kuò)增特異的靶DNA，以獲得足夠數(shù)量的DNA樣品，供體內(nèi)足跡試驗(yàn)使用。八 免疫沉淀技術(shù)八、染色體免疫沉淀技術(shù)它們都有一定的局限性，不足以充分反映生理?xiàng)l件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)情況。因?yàn)楦叩壬锏幕蚪MDNA和DNA上的結(jié)合蛋白共同組成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，用以上所提到的方法分析得到的某段DNA與蛋白質(zhì)的相互作用的結(jié)果，在體內(nèi)則很可能由于染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的存在，而使DNA與蛋白質(zhì)難以接

14、近。因此，在生理狀態(tài)下，這段DNA很可能并不與其相對應(yīng)的因子相結(jié)合，是沒有功能的，反之亦然。另外，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)本身是動態(tài)的，DNA與非組蛋白在生理狀態(tài)下的相互作用通常是瞬時的，以上方法難以捕捉到發(fā)生在染色質(zhì)上的基因表達(dá)調(diào)控的瞬時事件。而染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)則可以找出在生理?xiàng)l件下某個DNA結(jié)合蛋白與DNA序列的結(jié)合位點(diǎn)，從而反映體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況。1、技術(shù)介紹在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，超聲波將染色質(zhì)打碎后，用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復(fù)合體。只有與目的蛋白結(jié)合的DNA片段才能夠被沉淀下來。2、主要步驟及內(nèi)容2.1 細(xì)胞的甲醛固定甲醛是一種高分辨率的可逆的

15、交聯(lián)劑，能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)。在甲醛的作用下DNA堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質(zhì)上的氨基及賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸的側(cè)鏈氨基與另外的DNA和蛋白質(zhì)上的氨基或亞氨基交聯(lián)在一起，在幾分鐘內(nèi)形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。交聯(lián)所用的甲醛終濃度約為1%，而交聯(lián)時間需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定?？梢约尤敫拾彼醽斫K止交聯(lián)反應(yīng)。2.2 超聲波斷裂染色質(zhì)甲醛交聯(lián)后的染色質(zhì)對限制酶和DnaseI高度抵抗，因此通常使用機(jī)械剪切力使得染色質(zhì)斷裂。打斷后的染色質(zhì)片段的平均長度應(yīng)該在500-1000bp左右（可以用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定）。2.3 氯化銫等密度離心純化交聯(lián)的染色質(zhì)

16、 氯化銫等密度離心可以除去未交聯(lián)的蛋白質(zhì)、DNA和RNA樣品中加入0.5%的十二烷基肌氨酸鈉，通常在4000rpm離心72h。離心后，在離心管的密度梯度頂部可以見到Sarkosyl-脂類-蛋白的聚集物。用連接到蠕動泵的0.25mm毛細(xì)管從梯度的底部分部收集染色質(zhì)組分，在4透析過夜。2.4 染色質(zhì)免疫沉淀和免疫沉淀復(fù)合體的純化用目的蛋白特異性的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀?？贵w的量要進(jìn)行優(yōu)化，$防止非特異的結(jié)合。用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀復(fù)合體。經(jīng)過洗滌除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用1%SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合體。2.5 交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純

17、化在免疫沉淀復(fù)合體中加入不含Dnase的Rnase，65保溫6h使交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。經(jīng)酚氯仿抽提-乙醇沉淀純化DNA。純化的DNA極少，可用色譜定量。2.6 染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析方法有許多種。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狹縫雜交和PCR分析;如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因組上的分布情況,找出反式作用因子的結(jié)合位點(diǎn),可以采用Southern雜交、ChIP克隆和DNA芯片方法。2.6.1 驗(yàn)證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結(jié)合 通過狹縫雜交（Slot-blot）實(shí)驗(yàn)用靶序

18、列特異性探針與染色質(zhì)免疫沉淀的DNA雜交來驗(yàn)證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結(jié)合。其相對富集率可以通過比較探針與特異性和非特異性抗體(即未免疫的IgG)所免疫沉淀的M5A的雜交信號而測定。還可以根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)引物，用定量或半定量PCR的方法，比較特異性和非特異性免疫抗體所沉淀的DNA的PCR產(chǎn)物的量；或者比較根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)的引物和遠(yuǎn)離靶序列設(shè)計(jì)的引物的PCR產(chǎn)物的量。比值越大，則說明靶M5A序列與目的蛋白相結(jié)合的可能性越大。2.6.2 研究未知蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合位點(diǎn)如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因組上的分布情況，則可用Southern雜交法。用免疫沉淀的DNA本身就可以作為Southern探針。但是因?yàn)槊庖叱恋砀患腄NA極少（通常只有幾個8ng),通常需要用PCR方法擴(kuò)增富集的DNA探針。將免疫沉淀的DNA用限制酶切后，與合適的接頭相連，然后用與接頭序列匹配的引物擴(kuò)增該DNA序列。以放射性標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物作Southern雜交的探針，掃描整個基因組確定目的蛋白結(jié)合位點(diǎn)的分布情況。由于使用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)得到的結(jié)果是大量而又復(fù)雜的，因此運(yùn)用普通方法對其結(jié)果的分析和處理就顯得力不從心。近年來發(fā)展起來的基因芯片（chip）染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)相結(jié)合(chip-ChIP)的方法,大大促進(jìn)了在基因組水平上高通量對DNA和蛋白質(zhì)的相互作